Splikointi, peittäminen ja polyadenylaatio ovat kolme tärkeintä vaihetta, jotka liittyvät esi-messenger RNA:n käsittelyyn mRNA:ksi (pre-mRNA). Polyadenylaatioon (poly(A)) kuuluu pre-mRNA:n endonukleolyyttinen pilkkominen ja poly(A)-hännän lisääminen pilkkomiskohtaan . Yksittäisellä pre-mRNA:lla on yleensä muutama pilkkomis-/polyadenylaatiokohta (C/P) (polyA-kohdat tai pA) . Vaihtoehtoinen polyadenylaatio (APA) voi lopulta tuottaa useita mRNA:n polyadenylaation isomuotoja .

Nykykäsityksen mukaan APA on kokonaisvaltainen prosessi, joka toteutetaan useiden pienten molekyylien koordinoivalla vaikutuksella. 3′-prosessointitekijät ovat APA-säätelyn tärkeimmät kohteet . Tyypillinen APA-prosessointi sisältää seuraavat vaiheet: (1) CFIm (cleavage factor I) sitoutuu pre-mRNA:n UGUA-kenttään pA-kohdan yläjuoksulla ja houkuttelee CPSF:n (cleavage and polyadenylation specificity factor) ja CSTF:n (cleavage stimulation factor) kokoontumaan RNA-polymeraasi II:n päähän; (2) RNA-polymeraasi II:n edetessä CPSF sitoutuu pA-signaalisekvenssiin (esim. AAUAAA) ja CSTF siirtyy uuteen mRNA:n esiasteeseen sitoutuen GU- tai U-rikkaaseen sekvenssiin; (3) CPSF ja CSTF aloittavat ~ 35 nukleosidin pilkkomisen pA-signaalisekvenssin jälkeen, ja tuman polyadenylaatiota sitova proteiini (PABPN1) sitoutuu polyadenylaation häntäsekvenssiin aloittaakseen PAP-prosessin; (4) samalla kun PAP-välitteinen polyadenylaatio jatkuu, valmistetaan ~ 50-250 nukleotidin (nt) pituisia adenosiinihäntiä (organismin lajista riippuen) ja CPSF dissosioituu sitoutumissekvenssistään; (5) PABPN1 toimii molekulaarisena hallitsijana tämän APA:n etenemisen aikana määrittäen, milloin polyadenylaatioprosessin on pysähdyttävä; (6) PAP alkaa dissosioitua, vaikkakin PABPN1 ylläpitää edelleen sitoutumisasemaansa. Edellä mainittujen kuuden vaiheen yhdistelmä yhdessä 5′-kappausprosessin kanssa edistää mRNA:n kypsymistä ja lopullista vientiä ytimestä sytoplasmaan.

Noin 50 ~ 80 %:lla nisäkkäiden pre-mRNA-transkripteistä on enemmän kuin yksi pA-kohta . mRNA:n 3′-UTR:ssä on keskeisiä RNA-säätelyelementtejä, jotka määräävät, milloin, missä ja kuinka paljon mRNA-transkripti kääntyy . APA on keskeinen 3′-UTR:n transkription jälkeinen säätelymekanismi. 3′-UTR:n APA-isomuodoilla on erilaisia rooleja mRNA:n stabiilisuuden, lokalisoinnin, puoliintumisajan ja toimintojen määrittämisessä. Lisäksi aiemmat tutkimukset osoittivat, että APA on mukana taudin etenemisessä ja lääkeherkkyydessä, erityisesti kromatiinin modifioijiin kohdistuvien lääkkeiden osalta . Vaikka APA-tutkimus on vielä alkuvaiheessa, sen ainutlaatuinen transkription jälkeinen säätelyvaikutus tekee siitä mahdollisesti sekä syövän ennusteen ja diagnoosin biomarkkerin että uuden kohdehoidon kehittämisen kohteen .

Miten APA moduloi pre-mRNA:ta

PPA:n sijainnin perusteella APA voidaan luokitella kahteen pääluokkaan: UTR-APA (Kuva 1a) ja koodaavan alueen-APA (CR-APA) (Kuva 1b-d). CR-APA:ssa vaihtoehtoiset pA:t sijaitsevat eksoneissa tai introneissa. Näin ollen CR-APA vaikuttaa koodaaviin alueisiin vaihtoehtoisen pilkkomisen (AS) kautta, mikä johtaa sellaisten proteiini-isomuotojen syntymiseen, joilla on erilaiset C-terminaalit. UTR-APA:ssa vaihtoehtoiset pA:t sijaitsevat 3′-UTR:ssä, mikä johtaa transkriptiotuotteisiin, joilla on sama koodausrunko mutta vaihtelevat 3′-UTR:t. UTR-APA ja CR-APA. UTR-APA:ssa vaihtoehtoinen PAS sijaitsee 3′-UTR:ssä. Sen vuoksi UTR-APA voi tuottaa transkriptejä, joiden UTR-pituudet vaihtelevat muuttamatta koodaavia sekvenssejä. CR-APA:n eri tyypit voivat tuottaa transkriptejä, joiden koodaava sekvenssi on typistetty. d Keltaista käytetään merkitsemään laajennettu eksoni. Esimerkiksi AS, e-konstitutiivinen splikointi; f eksonien ohittaminen/ sisällyttäminen; g vaihtoehtoiset 5′-liitospaikat; h vaihtoehtoiset 3′-liitospaikat; i intronin säilyttäminen; j toisiaan poissulkevat eksonit

Esimuotoista mRNA:ta edeltävä 3′-prosessointikompleksi koostuu useista elementeistä, mukaan lukien kanoninen poly(A)-signaalisekvenssi AAUAAA tai sen läheiset variaatiot (mm.esim. AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAAA, AAAAAA, AAAAAG), joita hyödynnetään vaihtelevalla frekvenssillä eri puolilla genomia, tavallisesti 15-50 nts:n etäisyydellä pA-kohdasta . UGUA-elementit sijaitsevat usein pA-kohdan yläjuoksulla, U-rikkaat elementit lähellä pA-kohtaa ja U/GU-rikkaat elementit ~ 100 nts:n sisällä pA-kohdan alajuoksulla . Kuitenkin ~ 20 % ihmisen poly(A)-signaaleista ei ole U-/GU-rikkaiden alueiden ympäröimänä .

Nisäkässolujen 80 ydintekijästä noin 20 osallistuu C/P-koneistoon . Yleensä nämä ydintekijät voidaan jakaa neljään elementtiin seuraavasti (kuva 2) :

CPSF (pilkkomis- ja polyadenylaatiospesifisyysfaktori, cleavage and polyadenylation specificity factor) koostuu CPSF1-CPSF4:stä (tunnetaan myös nimillä CPSF160, CPSF100, CPSF73 ja CPSF30), WDR33:stä ja FIP1F1L1:stä (kutsutaan myös nimellä Fip1) . Nykyisen käsityksen mukaan WDR33 ja CPSF4 ovat suoraan vuorovaikutuksessa pAs:n kanssa, ja CPSF3 suorittaa endonukleolyyttisen pilkkomisen . Kompleksina toimiessaan CPSF tunnistaa polyadenylaation signaalisekvenssin AAUAAA ja pilkkoo pre-mRNA:n. Tämä tarjoaa sekvenssispesifisyyden, jolla voi olla tärkeä rooli pA-kohdan valinnan, geeniekspression, syöpäsolujen migraation, metastaasin ja lopulta taudin lopputuloksen säätelyssä . CPSF73 on CPSF-kompleksin osana endonukleaasi, joka pilkkoo pre-mRNA:ta pA-kohdassa . Oksidatiivisessa stressissä CPSF73 kuitenkin translokoituu ytimestä sytosoliin ja aiheuttaa merkittävää polyadenylaatioaktiivisuuden estymistä eturauhassyövissä . Lisäksi CPSF-kompleksin jäsen Fip1 toimii mahdollisesti solujen itseuudistumisen säätelijänä. Fip1:n poistaminen hiiren alkion kantasoluista (ESC) johtaa nimittäin solujen erilaistumattomien tilojen ja itseuudistumiskyvyn menettämiseen, mikä johtuu ensisijaisen distaalisen poly(A)-kohdan (dpA) käytöstä, mikä johtaa viime kädessä valittujen geenien 3′-UTR:n pidentymiseen, jotka määrittävät solun kohtalon .

CSTF (cleavage stimulation factor) koostuu CSTF1:stä, CSTF2:sta ja CSTF3:sta (50 kDa, 64 kDa ja 77 kDa), ja sillä on keskeinen rooli pilkkomisreaktiossa . CSTF-kompleksi voi sitoutua U- tai GU-rikkaaseen kenttään pilkkoutumiskohdan alapuolella vauhdittaakseen pilkkoutumista. Esimerkiksi CSTF2, joka tunnetaan myös nimellä CSTF64, on suoraan vuorovaikutuksessa U/GU-rikkaan alueen kanssa muokkaamaan 3′-terminaalisen prosessoinnin tehokkuutta . Joissakin tutkimuksissa raportoitiin, että CSTF ei ainoastaan edistä pA:n käyttöä, vaan vaikuttaa myös solujen lisääntymiseen ja toimii mahdollisesti syövän invaasion ja ennusteen biomarkkerina . CSTF64 toimii välttämättömänä polyadenylaatiotekijänä ja 3′-UTR:n lyhenemisen pääsäätäjänä useissa eri kasvaintyypeissä. CSTF64:n ilmentymisen havaittiin liittyvän keuhkosyövän huonoon ennusteeseen, ja CSTF64:n yliekspressio edisti keuhkosyöpäsolujen proliferaatiota ja invaasiota .

CFI ja CFII (pilkkoutumistekijät I ja II) koostuvat CFIm25:stä (tunnetaan myös nimellä NUDT21/nudix-hydrolaasi 21 / CPSF5), CFIm59:stä ja CFIm68:sta, jotka kaikki kiinnittyvät ylävirtaan konservoituneesta UGUA-kuvaajamotiivin yläjuoksun puolelle välittäen pilkkoutumisreaktiota . CFIm-sitoutuminen voi toimia pA-kohtien ensisijaisena määräävänä tekijänä sulkemalla pois koko pA-alueen ja indusoimalla siten APA-kohdan valinnan . Myös muut proteiinit, kuten symplekin, poly(A)polymeraasi (PAP) ja poly(A)-sidontaproteiini (PAB), voivat säädellä APA-kohdan valintaa. PAB-proteiinit (PABII, RBBP6, PABPN1) sitoutuvat kasvavaan poly(A)häntään ja estävät CPSF:n ja poly(A)-polymeraasin välisen vuorovaikutuksen. Nämä toiminnot tapahtuvat pääasiassa silloin, kun häntä on ~ 250 nts ja joiden tarkoituksena on kontrolloida poly(A)- hännän pituutta APA:n edetessä .

C/P-koneistoon osallistuvat tekijät osallistuvat yleensä APA:n säätelyyn. Niistä CFIm25 on tunnistettu tärkeimmäksi APA:n globaaliksi säätelijäksi, jonka knockdown ei ainoastaan indusoi globaalia siirtymistä proksimaalisen poly(A)-signaalin käyttöön, vaan myös parantaa kohdegeenin vakautta ja ilmentymistä . Huang et al. raportoivat, että CFIm25:n vähentäminen lisää merkittävästi CCND1:n ja GSK3β:n transkriptiotasoja sekä vähentää dPAS:n käyttöä useissa onkogeeneissä (IGF1R, CCND1 ja GSK3β) . Lisäksi geeniontologia-analyysit (GO) osoittivat, että CFIm25 ei ainoastaan moduloi APA:ta MAPK-signalointireittien kautta, vaan se liittyy myös syöpään liittyviin signalointi- ja proteiinien ubikitinaatio-signalointireitteihin . Lisäksi CFIm25:n ja CFIm68:n, mutta ei CFIm59:n, poistaminen johtaa proksimaalisen polyadenylaatiopaikan valintaan HEK293-soluissa . Xia et al. kuitenkin raportoivat, että CFIm25:n ilmentymisessä ei ole eroja kasvainkudoksen ja terveen kudoksen välillä . Kubo et al. raportoivat myös, että CFIm:llä ei ehkä ole merkitystä poly(A)-kohdan valinnassa . Lisäksi Takagaki et al. osoittivat, että CSTF64 on ensimmäinen tekijä APA:n 3′-pään prosessoinnissa ja että IgM voi käyttää APA:ta hiiren B-solujen aktivoimiseen . Vaikka vaikuttaa siltä, että CFIm:llä on keskeinen rooli APA:n säätelyssä, sen tarkka rooli on edelleen epäselvä .

RNA:ta sitovat proteiinit (RBP:t) voivat myös vaikuttaa APA:n kykyyn kohdistaa mRNA:t kilpailemalla polyadenylaatiokoneiston proteiinien kanssa tai tehostamalla niiden sitoutumista kohdekohtiinsa . Xiang et al. analysoivat globaalit APA-profiilit laajasta tietokannasta eri syöpätyypeistä ja ehdottivat, että PABPN1 on APA-profiilin pääasiallinen säätelijä eri syöpätyypeissä. CTRP-tietokokonaisuus osoitti, että PABPN1-ekspressio korreloi tilastollisesti herkkyyden kanssa 31 lääkkeelle . RBP:t voivat toimia yksin estääkseen muiden APA-tekijöiden sitoutumisen proksimaalisiin poly(A)-kohtiin tai vaikuttaa APA-valintaan RNA:n vakauden ylläpitämisen kautta . Lisäksi RBP:t voivat säädellä dynaamista APA-profiilia ja edistää mitoosin ja meioosin välistä siirtymää .

Miten APA:ta säädellään

APA on hyvin kattava molekyylibiologinen prosessi, johon liittyy lukuisia soluelementtejä. Tällä hetkellä emme vielä tiedä paljon tästä ainutlaatuisesta biologisesta prosessista. Tilanne on kuitenkin parantunut nopeasti hyvin lyhyessä ajassa sen jälkeen, kun tiedeyhteisö on aistinut APA:n merkityksen solubiologiassa ja sen mahdollisen roolin uutena syöpähoidon kohteena. APA on lukuisten ydintekijöiden dynaamisesti ja spatiotemporaalisesti koordinoitu prosessi. Esimerkiksi CFIm voi sitoutua pre-mRNA:n spesifiseen RNA-sekvenssiin, minkä jälkeen se rekrytoi ydintekijä CPSF:n vuorovaikutuksen kautta CPSF:n alayksikön, hFip:n15 , kanssa. CSTF-64 voi olla vuorovaikutuksessa CPSF73:n mutta ei CFIm25:n kanssa. Havaittiin, että sekä CSTF64- että CPSF73-tasot ovat koholla soluissa, jotka vaeltavat terveeseen kudokseen, mutta eivät CFIm25-tasolla . CFIm osallistuu pre-mRNA:n 3′-prosessointikompleksin kokoamisen varhaiseen vaiheeseen stimuloimalla tai tukahduttamalla vaihtoehtoisesti pilkkomista ja poly(A)-lisäystä riippuen sen omien tai muiden ydintekijöiden tasoista ja potentiaalisia pilkkomispaikkoja ympäröivästä RNA-sekvenssistä .

Ydintekijöiden lisäksi APA:n säätelyyn osallistuu myös erilaisia fysiologisia olosuhteita, kuten paikallinen kromatiinirakenne, nukleosomien sijoittuminen, DNA:n metylaatio ja histonimodifikaatiot . Mielenkiintoista on, että jotkin 5′-terminaaliseen peittämiseen osallistuvat tekijät voivat myös vaikuttaa sekä pilkkomisen että polyadenylaation tehokkuuteen .

Lisäksi APA:ta voidaan säädellä transkriptiotasolla. Transkriptiokoneisto, kuten transkription käynnistyminen, eteneminen ja pilkkominen, vaikuttaa todennäköisesti polyadenylaation tehokkuuteen ja spesifisyyteen . Siksi promoottorin alueen erityisten sekvenssielementtien ja poly(A)-kohdan valinnan välisen yhteyden tutkiminen auttaa meitä suuresti tämän mielenkiintoisen ilmiön taustalla olevan mekanismin paljastamisessa, mikä voi mahdollisesti auttaa uuden syöpähoitostrategian kehittämisessä .

Miten APA:ta analysoidaan metodologisesti

Sen jälkeen, kun pA:n vaikutukset IgM- ja dihydrofolaattireduktaasi (DHFR) -geenin koodaukseen havaittiin vuonna 1980, APA:n tunnistamiseksi ja tutkimiseksi on kehitetty joukko tiukkoja tutkimusmenetelmiä ja -strategioita, kuten seuraavan sukupolven sekvensointitekniikka (NGS) Poly(A)-ClickSeq . Näiden uusien menetelmien tuella, erityisesti NGS-tekniikan kehittyessä ja näiden geeniekspressiovarianttien sekvensointitietojen nopean kertymisen myötä kokeellisesti määritetyt geneettiset pA:n tietokannat laajenevat jatkuvasti .

Perustuen 3′-rikastettuihin RNA-seq-protokolliin, APA-analyysimenetelmät voidaan luokitella pääasiassa kahteen luokkaan: oligo(dT)-priming-pohjaiset menetelmät ja RNA-manipulointiin perustuvat menetelmät . Koska vain mRNA:n 3′-termiiniin kartoitetut lukemat ovat käyttökelpoisia APA:n löytämiseksi, lukemien määrä rajoittaa näitä menetelmiä. Jos 5′- ja 3′-termiinien lukupeitto on alhainen, RNA-seq ei sovellu pA:iden tarkkaan ja laajaan tunnistamiseen. Lisäksi toinen haaste on ratkaista lukukartoituksen epäselvyys, joka johtuu isoformien transkriptien päällekkäisyydestä. Vaikka lukupituus on rajoitettu, on kehitetty useita RNA-seq-algoritmeja 3′-UTR:n pituuden suhteellisten muutosten kvantifioimiseksi ja siten APA-tapahtumien ennustamiseksi. Viime vuosina on myös kehitetty useita pA:n havaitsemis- ja APA-analyysimenetelmiä ja -algoritmeja, kuten Dynamic Analyses of Alternative PolyA Adenylation (Dynamic Analyses of Alternative PolyA Adenylation, DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA ja Change Points . Gruberin ja Zavolanin vuonna 2019 tekemässä katsauksessa vertailtiin näitä menetelmiä .

DaPars on niistä suosituin data-analyysimenetelmä, vaikka QAPA on tehokkaampi ja herkempi . DaPars tunnistaa dynaamiset pA:t RNA-seq-datan perusteella ja käyttää sitten regressiomallia dynaamisten APA-tapahtumien de novo-tunnistamiseen ja kvantifiointiin kahden olosuhteen välillä riippumatta aiemmasta APA-merkinnästä. Todennäköisyys tuottaa sekvensoituja lukemia on yhtenäinen yksittäisten isoformien välillä. pA:t esiintyvät paikoissa pitkin geenipaikkoja, joissa on selvä pudotus RNA-seq-lukupeitossa . Kun mahdollinen RNA-seq-epätasaisuusharha on korjattu geenirunkoa pitkin, proksimaalisen APA-kohdan tarkka sijainti voidaan tunnistaa, ja tilastollisesti merkittävät dynaamiset APA:t ja niiden toiminta havaitaan. DaParsin keskeinen metodologinen innovaatio on de novo APA-tapahtumien suora päättely olemassa olevasta RNA-seq-datasta ilman lisäkokeita. DaParsin etuna on myös se, että se voi ratkaista naapurigeenien päällekkäisyydet, jotka voivat antaa vääriä positiivisia tuloksia, nostamalla raja-arvoja. Koska lukupeitto on epätasainen pitkin lokuksia, tämä menetelmä kuitenkin rajoittaa de novo poly(A)-kohdan havaitsemisen tarkkuutta lisäämällä väärien positiivisten lukemien osuutta.

QAPA johtaa APA:n kvantitatiivisesti tavanomaisista RNA-seq-tiedoista arvioimalla suoraan absoluuttisen vaihtoehtoisen 3′-UTR-isoformin ekspressiota. Sen jälkeen se laskee kunkin isoformin suhteellisen ilmentymisen kaikkien isoformien joukossa APA:n arvioimiseksi. QAPA:n rajoituksena on, että se edellyttää ennalta määriteltyjä pA:ta. Tätä ongelmaa voidaan kuitenkin lieventää luomalla laajennettu annotoitujen pA:iden resurssi, joka sisältää tietoja 3′-UTR RNA-seq:sta ja muista resursseista . Koska transkriptien 3′-loppupäässä on lukupeittovirheitä, ei-templatoitujen poly(A)-hännän sisältävien lukujen saanto on heikko ja lukujen kartoitus on epäselvää päällekkäisten transkriptien isoformien kohdalla, kanonisiin RNA-seq-tietoihin perustuvat menetelmät ovat rajallisia, kun pyritään kartoittamaan täsmällisesti pA:t . Molekyyliteknologian kehittymisen myötä APA:n tutkimusmenetelmät ovat kuitenkin jatkuvasti lisääntyneet. Wang et al. käyttivät CRISPR/Cas9-menetelmää APA:n biologisen toiminnan tutkimiseen muokkaamalla heikkoa poly(A)-signaalia kanoniseksi poly(A)-signaaliksi ja ohjaamalla signaalit kohdistumaan tiettyihin poly(A)-kohtiin .

Lyhyesti sanottuna jokaisella nykyisin saatavilla olevalla APA-analyysimenetelmällä on omat etunsa ja rajoituksensa. Kanoniseen RNA-seq-dataan perustuvia analyysistrategioita hyödynnetään eniten APA-tutkimusyhteisössä.

Yksisolutason tutkimus Yksisolutason lähestymistavan etuna on, että sillä voidaan merkittävästi vähentää bulkkisoluista peräisin olevaa taustakohinaa, joka sisältää eri kudoksista tai erilaistumisvaiheista peräisin olevista soluista peräisin olevan RNA-materiaalin sekoitusta.

Yksisolutason analyysitekniikan kehittyessä APA:n vaihteluita solujen välillä on hiljattain alettu tutkia . Vaikka yhden solun APA-tutkimusta on harvoin tehty laajamittaisesti, tämä tekniikka toimii suuren syvyyden ja täyden pituuden yhden solun RNA-seq (scRNA-seq), mikä tekee siitä mahdollisen työkalun APA:n tarkkaan analysointiin. Jingle Bells ja scRNA-SeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/) hyödynsivät scRNA-seq-tietoaineistoja erilaisten syöpätyyppien tutkimiseen . Ye et al. raportoivat scRNA-seq-datan käytöstä dynaamisten APA-käytön vaihteluiden tutkimiseen eri luuytimen mononukleaarisolutyypeissä laajoista näytekokoelmista, jotka sisälsivät sekä terveitä kontrolleja että AML-potilaita. He havaitsivat, että terveisiin yksilöihin verrattuna AML-potilailla näyttäisi olevan pienempi APA:n monimuotoisuus kahdeksassa eri solutyypissä. Lisäksi he paljastivat, että APA-säätely osallistuu laajasti erytropoieesiin leukemian etenemisen aikana yhden solun tasolla. Analysoimalla 515 scRNA-seq-tietosarjaa, jotka oli poimittu 11 rintasyöpäpotilaalta, Kim et al. raportoivat, että solutyyppispesifinen APA voidaan tunnistaa yksittäisen solun tasolla 3′-UTR:n pituuden vaihtelun perusteella yhdessä geeniekspressiotason ja APA-mallien kanssa. Lisäksi he osoittivat, että rintasyövän immuunispesifisiä APA-signaattoreita voidaan mahdollisesti hyödyntää varhaisen vaiheen rintasyövän ennustemerkkinä .

APA ja vaihtoehtoinen pilkkominen: Vaikka APA:n ja vaihtoehtoisen splikoinnin (AS) välillä on merkittäviä eroja, sekä APA että AS voivat tuottaa erilaisia isomuotoja, jotka ovat jopa vuorovaikutuksessa toistensa kanssa pre-mRNA-prosessin aikana. Lisäksi APA:lla on neljä tyypillistä isoformia, kun taas AS:llä on kuusi (kuva 2). Useat eri ihmiskudoksista ja solulinjoista saatujen transkriptomisten tietojen perusteelliset analyysit paljastivat vahvan korrelaation APA:n ja AS:n välillä. Jos pA on terminaalisen eksonin sisällä, APA voi toimia erityyppisen AS:n, CR-APA:n, tavoin, jolla ei voi olla kehyksen sisäistä stop-kodonia tai 3′-UTR:ää ja joka todennäköisesti hajoaa nopeasti pysähtymättömän koodin välityksellä tapahtuvan mRNA:n hajoamisprosessin kautta (kuva 1b) . Shen et al. raportoivat, että APA ja splikointitekijä SRSF3 toimivat yhdessä solujen vanhenemisprosessin moduloimiseksi . Vaikka APA:lla voi olla rooli joissakin splikointitekijöiden välittämissä AS:issä, splikointitekijät voivat myös työskennellä APA-elementtien kanssa auttaakseen tässä prosessissa. Esimerkiksi U2AF2 ja RBP:t kykenevät vuorovaikutukseen ja rekrytoimaan CFI:n helpottamaan 3′-terminaalin muodostumista lähellä polypyrimidiiniratoja . Lisäksi CPSF-kompleksi voi olla vuorovaikutuksessa splikointitekijä TFIID:n (transkriptiotekijä II D) kanssa RNA-polymeraasi II:n säätelyssä . On myös havaittu, että U1 snRNP (pieni ydinribonukleoproteiini) voi toimia intronien sisällä estämällä ennenaikaista pilkkomista ja polyadenylaatiota. U1:n köyhtyminen johtaa myös intronien poly(A)-signaalien aktivoitumiseen ja aiheuttaa genomin laajuisen APA:n .

AS ja APA myös kilpailevat keskenään CR-APA:ssa. Esimerkiksi splikointitekijä 3B:n alayksikkö1:n (U2 snRNP:n komponentti, jota kutsutaan myös SF3b1:ksi) ablaatio voi aktivoida intronin PAS:n. U1 snRNP voi myös itsenäisesti vaikuttaa APA:n splikointitoimintaan . Koska U1 snRNP voi sitoutua transkriptin 5′-terminaaliseen alueeseen ja estää mahdollisen pilkkomistekijän tunnistamisen, U1 snRNP:n tyrmäys lisää pA-kohtien käyttöä intronien sisällä lähellä kyseistä transkriptin aluetta . Movassat et al. osoittivat kuitenkin, että APA:n ja AS:n välinen yhteys rajoittuu terminaalisiin introneihin . He osoittivat myös, että CstF64:n knockdown voi epäsuorasti vaikuttaa hnRNP A2/B1:n AS:ään, mutta ei APA:n, HeLa-soluissa .

Miten APA säätelee solusykliä

On olemassa monia geenejä, mukaan lukien TP53, CDC6 (solunjakautumissykli 6), CyclinD1 (CCND1) ja CDK (sykliini-riippuvainen kinaasi), jotka liittyvät solusyklin tarkistuspisteisiin ja säätelevät solusyklin etenemistä. Koska pre-mRNA:ssa on yleensä useampi kuin yksi pA-kohta, solusyklin kannalta merkitykselliset geenituotteet moduloituvat APA-mekanismilla ja tuottavat erilaisia isomeerejä. DNA:n replikaation tärkeän säätelijän CDC6:n 3′-UTR:n lyheneminen liittyy korkeampiin CDC6-proteiinipitoisuuksiin ja lisääntyneeseen S-vaiheeseen siirtymiseen rintasyöpäsoluissa . Sykliini D1, jolla on kriittinen rooli G1-S-vaiheen siirtymän edistämisessä monissa solutyypeissä, on APA-säätelyn kohteena sekä UTR-APA- että CR-APA-mekanismien kautta . Lisäksi Xiang et al. tutkivat APA-tapahtumiin liittyvien 20 532 geenin ylimmät 10 % ja havaitsivat, että useimmat näistä geeneistä osallistuvat kromatiinirakenteeseen liittyviin toimintoihin, mikä viittaa APA-prosessoinnin ja kromatiinirakenteen modifikaation väliseen suhteeseen . Mitra et al. havaitsivat, että APA toimii solusyklin ja kudosmigraation välisenä yhteytenä analysoimalla hiirten dermaalisia poistohaavoja . He osoittivat, että haavojen vieressä olevat proliferoivat solut ilmentävät enemmän APA-tekijöitä kuin rauhalliset fibroblastit haavoittumattomassa ihossa. PIGN:n, joka säätelee solusykliä olemalla vuorovaikutuksessa karan kokoonpanon tarkistuspisteproteiinien kanssa, havaittiin sisältävän 6 pA-kohtaa 3′-UTR:ssä (kuva 3) .

Miten APA vuorovaikuttaa miRNA:n kanssa transkription jälkeisessä modulaatiossa

Yli 50 % konservoiduista mikroRNA:ista (miRNA:ista) kohdistuu kohdepaikkoihin, jotka sijaitsevat proksimaalisten pA:iden alapuolella nisäkkäiden geeneissä. Tämän seurauksena UTR-APA:lla on keskeinen rooli transkriptien ja miRNA:iden välisen vuorovaikutuksen säätelyssä . APA on äskettäin tunnistettu laajalle levinneeksi mekanismiksi, joka kontrolloi geenin vakautta ja ilmentymistä. MiRNA:n kohdentumiskohdat sijaitsevat useimmiten 3′-UTR:ssä . Transkriptit, joiden 3′-UTR:n pituus on lyhyempi, ovat yleensä vakaampia, koska ne menettävät miRNA:iden kohdistuspaikkoja. Aiemmin on osoitettu, että APA on ratkaiseva säätelymekanismi useissa syöpätyypeissä, kuten glioblastoomakasvaimessa, hepatosellulaarisessa karsinoomassa, eturauhassyövässä ja rintasyövässä . Gruber et al. kuitenkin raportoivat, että 3′-UTR:n lyhentymisellä on vain rajallinen vaikutus hiiren ja ihmisen T-lymfosyyttien proliferaatioon. Se osoitti myös, että kaikki APA-tapahtumat eivät liity korkeampiin proteiinitasoihin . Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että APA:n vaikutukset mRNA:n stabiilisuuteen ja ribosomien latautumiseen ovat marginaalisia riippuen solutyyppikohtaisesta miRNA-ekspressiosta ja RNA:ta sitovien proteiinien saatavuudesta . Tyypillinen esimerkki on PAX3-geenin ilmentymisen säätely. PAX3 on merkittävä myogeenisen erilaistumisen säätelijä, jonka transkriptin 3′-UTR:ssä on miR-206:n kohdekohta. PAX3-isoformit osoittavat kuitenkin erilaisia erilaistumismalleja eri lihastyypeissä .

APA voi myös moduloida introneissa sijaitsevia miRNA-kohteita. ZFR-geenin kohteena on sen introninen miRNA (miR-579) U87-solulinjassa. Hinske ym. raportoivat myös, että APA-signaalilla on merkitystä miRNA:n negatiivisen palautteen välittämisessä ZFP-geenille .

APA vaikuttaa geeniekspressioon paitsi lyhentämällä 3′-UTR:ää miRNA:n kohdentumiskohtien poistamiseksi, myös muiden molekulaaristen mekanismien kautta. Masamha et al. raportoivat, että CFIm25 ja miR-23 tukahduttivat itsenäisesti yhden glutaminaasi-isomuodon 3′-UTR:n ekspressiota . Näin ollen, vaikka mRNA pakenee miRNA-suppressiota lyhentämällä 3′-UTR:ää miRNA:n kohdekohdan poistamiseksi (kanoninen APA-mekanismi), myös muita APA:n ja miRNA:n vuorovaikutusmekanismeja on olemassa rinnakkain.

Näkymät

APA on suhteellisen uusi biolääketieteellinen tutkimusalue. Vaikka APA-tutkimuksessa on viime vuosina saavutettu joitakin virstanpylväitä, paljon on vielä selvitettävää (kuva 4). APA-tutkimuksissa on viime vuosina keskitytty erilaisten trans-aktiivisten tekijöiden suoriin vaikutuksiin. Tulevissa tutkimuksissa keskitytään toivottavasti näiden trans-aktiivisten tekijöiden signaalisäätelyyn molekyyli- ja solutasolla. Tiedetään, että APA:lla on ratkaiseva rooli pre-mRNA:n muokkaamisessa ja myöhempien mRNA-isoformien spesifisyyden ja vakauden määrittämisessä. APA osallistuu synnynnäisen antiviraalisen immuunivasteen modulointiin, syövän käynnistymisen ja ennusteen säätelyyn sekä lääkeresistenssin kehittymiseen. Samalla APA käyttäytyy eri tavoin yksittäisen geenin, solutyypin, kudostyypin ja jopa sairauden mukaan. APA:n ja sen kokonaisvaltaisten säätelymekanismien ymmärtäminen ihmisen sairauksissa avaa uuden väylän täsmälääketieteen ja personoidun lääketieteen tavoittelulle.

.