Genome sequencing, assembly and annotation

Sekvensoimme O. sinensiksen Tiibetin Nyingchin piirikunnasta, Kiinasta. Teimme WGS-analyysin seuraavan sukupolven sekvensointialustoilla Roche 454 ja Illumina HiSeq 2000. Näin saatiin aikaan ~5,4 Gb:n puhtaat sekvenssidatatat, jolloin saatiin vastaavasti noin 45,1-kertainen genomipeitto (lisätaulukko S1). Arvioimme, että genomin koko on ~124,08 Mb ja ~119,8 Mb virtaussytometrian ja sekvensoitujen lukujen 17-mer-syvyysjakauman perusteella (täydentävät kuvat S1-2 ja täydentävä taulukko S2). O. sinensis -genomi koottiin ensin Rochen 454:n pitkistä lukemista Newblerin16 avulla, minkä jälkeen valmiiksi kootut kontigit koottiin Illuminan mattiparisekvensointilukemien avulla SSPACE:n17 avulla. Näin saatiin lopulta ~116,4 Mb:n genomikokoonpano, joka kattaa ~97 % arvioidusta genomin koosta ja sisältää 156 scaffoldia (>2 Kb), joiden ScafN50-arvo on ~3 Mb, ja 9 141 contigia (N50 = 21 423 bp) (taulukko 1 ja lisätaulukot S3-4). Genomikokoonpanon laadun validoimiseksi linjasimme ensin kaikki julkisissa tietokannoissa saatavilla olevat O. sinensis -lajin DNA:t ja ilmaistut sekvenssitunnisteet (EST:t), ja saimme 98,85 %:n ja 95,33 %:n kartoitusprosentin (Supplemental Table S5). Toiseksi kartoitimme kaikki puhtaat Roche 454:n pitkät lukemat (~1,84 Gb) koottuihin genomisekvensseihin, ja havaitsimme lähes täydellisen kohdistuksen, jonka kartoitusaste oli 99,01 % (Supplemental Table S5). Kolmanneksi kokoamiemme transkriptien kohdistus koottuun genomiin oli hyvä; 11 742 transkriptistä 91,29 % kartoitettiin (transkriptien kattavuus ≥80 % ja identiteetti ≥90 %; Supplemental Table S5). Lopuksi arvioimme O. sinensis -kokoonpanon täydellisyyttä BUSCO18:n avulla; 94,0 %, 4,0 % ja 1,8 % 1 315:stä odotetusta Ascomycota BUSCO:n konservoidusta geenistä tunnistettiin täydellisiksi, pirstaleisiksi ja puuttuviksi O. sinensis -kokoonpanossamme (Supplemental Table S5).

Loimme ~15,05 Gb RNA-sekvensointidataa (RNA-Seq), joka saatiin yhteensä kuudesta kirjastosta, jotka edustavat kolmea pääkehitysvaihetta, auttaaksemme geenien ennustamisessa (Täydentävä kuva S4 ja Täydentävät taulukot S6,7). Yhdessä ab initio -ennusteen, proteiini- ja EST-kohdistusten, EvidenceModeler-kombinaation ja lisäsuodatuksen kanssa määrittelimme 7 939 proteiinia koodaavaa geeniä (taulukko 1 ja lisätaulukko S8). Näistä ennustetuista geeneistä noin 97,0 prosenttia voitiin luokitella toiminnallisesti ja 71,51 prosenttia tukea RNA-Seq-tiedoilla (lisätaulukot S9-11). Ascomycota-linjan BUSCO:n avulla havaitsimme lisäksi, että 94,4 %, 3,6 %, 1,8 % ja 0,2 % geeneistä oli täydellisiä, pirstaleisia, puuttuvia ja päällekkäisiä, mikä osoittaa geeniannotaatiomme hyvää laatua (lisätaulukko S11). Teimme myös homologihakuja ja annotoimme ei-koodaavia RNA-geenejä (ncRNA), jolloin saimme tulokseksi 146 siirtorNA-geeniä (tRNA), 33 ribosomaalista RNA-geeniä (rRNA), 70 pientä nukleolaarista RNA-geeniä (snoRNA-geenit) ja 15 pientä nukleaarista RNA-geeniä (snRNA-geenit) (Täydentävä kuva S6 ja Täydentävä taulukko S12). Toistosekvenssien annotointi osoitti, että transponoituvien elementtien (TE) osuus oli noin 74,67 % kootusta genomista ja 80,07 % raakalukemista, mikä osoittaa, että ~5,45 % kokoamattomasta genomista koostuu TE:istä (lisätaulukot S13-14). GC-pitoisuus oli 43,09 % koko genomissa ja 61,49 % koodaavissa sekvensseissä (täydentävä kuva S3; täydentävät taulukot S4 ja S8). Annotoimme 8 918 yksinkertaista sekvenssitoistoa, jotka tarjoavat arvokkaita geneettisiä markkereita kiinalaisen lierosienen tulevien jalostusohjelmien avuksi (lisätaulukot S15-16 ja lisäkuva S7).

Retrotransposonien aiheuttama genomin laajeneminen ja ei-kollineaaristen geenien massiivinen poistaminen

Genomin koon vertailu osoitti, että O. sinensis -sienen genomi oli lähes 3,4-kertaisesti suurempi kuin muiden entomopatogeenisten sienien Hypocreales-suvun sukuun kuuluvien sienien genomi (Täydennystaulukko S17 ja Täydentävä kuva S8A). Toistosekvenssianalyysi osoitti, että tämä laajeneminen johtui pääasiassa transponoituvien elementtien nopeasta lisääntymisestä. MULE-elementit olivat selvästi runsaimmat, sillä niiden osuus O. sinensis -genomista oli ~1,6 % (~1,9 Mb) ja yli 59 % O. sinensis -lajin DNA-transposoneista. Retrotransposonit, enimmäkseen pitkien terminaalisten toistojen (LTR) retrotransposonit, muodostivat ~59,76 % O. sinensis -genomista, ja niiden laajamittainen leviäminen tapahtui noin ~38 miljoonaa vuotta sitten (MYA) (Supplemental Figure S9).

O. sinensis -genomin laajenemista ajavien LTR-retrotransposonien nopean monistumisen vastakohtana toinen merkittävä piirre on proteiineja koodaavien geenien dramaattinen häviäminen O. sinensis -linjassa verrattuna muihin entomopatogeenisiin sieniin. O. sinensiksen yhteensä 7 939 proteiinia koodaavaan geeniin verrattuna muissa entomopatogeenisissä sienissä, esimerkiksi Metarhizium anisopliae (10 582)19, Metarhizium acridum (9 849)19, Cordyceps militaris (9 684)20, Beauveria bassiana (10 366)21 ja Tolypocladium inflatum (9 998)22 , oli keskimäärin yli 10 095 geeniä (taulukko 1). Geenien lukumäärän vähenemisen osoitti myös ei-kollineaaristen geenien tunnistaminen ja syntenialohkojen vertaileva analyysi O. sinensis- ja C. militaris -genomien välillä. Tunnistimme yhteensä 308 synteniikkalohkoa, jotka kattavat lähes 72,7 % (~23,4 Mb C. militarisissa vs. ~43,5 Mb O. sinensiksessä) C. militaris -genomista (Kuva 1A; Täydentävä kuva S10 ja Täydentävät taulukot S18-19). Näistä syntenisistä genomialueista ei-kollineaaristen geenien määrä väheni O. sinensiksessä (2127) verrattuna C. militarisiin (3259), mutta toistosekvenssien määrä lisääntyi (23,8 Mb O. sinensiksessä vs. 0,40 Mb C. militarisissa) (kuva 1B ja lisätaulukko S19). O. sinensiksessä kadonneiden 2 468 geenin toiminnallinen annotointi osoitti, että ne osallistuivat pääasiassa aminohappojen aineenvaihduntaan, kuten aminohappojen biosynteesiin (ko01230), arginiinin ja proliinin aineenvaihduntaan (ko00330) ja tyrosiinin aineenvaihduntaan (ko00350) (täydentävä kuva S11 ja täydentävä taulukko S20). Huomionarvoista on, että lähes 81 % toistosekvensseistä näissä 308 synteettisessä lohkossa oli LTR-retrotransposoneja, joista 40,4 % oli Gypsy-retroelementtejä (Kuva 1B ja Supplemental Table S19). Molekulaarisen ajoituksen perusteella arvioitiin, että tämä nimenomainen LTR-retrotransposonien luokka monistui ~38 Mya, mikä sopii yhteen Qinghai-Tibetin ylätasangon maankohoamisen kanssa (Kuva 1C).

Sienten patogeenisyyteen liittyvien geeniperheiden nopea evoluutio

Yksi O. sinensis -genomin silmiinpistävimmistä piirteistä on erittäin homologisten geeniparien vähyys. Ennustetuista 7939 proteiineja koodaavasta geenistä yksikään pari ei jakanut >90 %:n aminohappoidentiteettiä koodaavissa sekvensseissä, ja vain yksi pari jakoi >80 %:n aminohappoidentiteettiä (Kuva 2A ja Supplemental Table S21). Tämä piirre havaittiin myös läheisessä sukulaislajissa C. militaris ja ektomykorritsasienessä Tuber melanosporum 23:ssa. Verrattuna muihin entomopatogeenisiin sieniin, kuten B. bassiana ja C. militaris, O. sinensiksen monigeeniperheiden määrä oli vähäinen, ja ne muodostivat vain 8,7 prosenttia ennustetusta proteomista; useimmissa geeniperheissä oli vain kaksi jäsentä (täydentävä kuva S12). Geenien lisääntymisnopeus oli silmiinpistävän alhaisempi kuin geenien häviämisnopeus, ja Hypocreales-heimon viimeisimmästä yhteisestä esi-isästä (MRCA) löydetyistä 7800 geeniperheestä 1756 näytti hävinneen O. sinensiksessä (kuva 2B). O. sinensis -genomin näin tiivis geenikoodausavaruus viittaa tämän pitkälle erikoistuneen sienen luonteeseen, jolla on vähäinen kyky sopeutua useisiin ympäristövihjeisiin.

Ymmärtääksemme sellaisten geeniperheiden evoluutiota, jotka liittyvät sienien patogeenisyyteen ja ylänköön sopeutumiseen ankariin ympäristöihin, tutkimme sellaisten geeniperheiden toiminnallisia ominaisuuksia, jotka ovat kokeneet laajenemisia tai supistumisia O. sinensiksessä. O. sinensis -genomissa havaittiin huomattava laajeneminen geeniperheissä, jotka liittyvät pääasiassa sienipatogeenisyyteen, mukaan lukien peroksidaasiaktiivisuus (PF01328; P < 0.01), seriinihydrolaasi (PF03959; P < 0,01), deuterolysiini-metalloproteaasi (M35) peptidaasi (PF02102; P < 0,01) ja sytokromi P450 (PF00067; P < 0,01) (lisätaulukko S23). Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että laajennetut geeniperheet ovat myös toiminnallisesti rikastuneet Pfam-luokkaan glukoosi-metanoli-koliini (GMC) oksidoreduktaasi, joka osallistuu hyönteisten moltingin ekdysteroidiaineenvaihduntaan (Supplemental Table S23). Verrattaessa muihin entomopatogeenisiin sieniin O. sinensis -linjan geeniperheiden laajeneminen havaittiin myös siten, että Pfam-termit, jotka liittyvät oletettavasti matalaan lämpötilaan sopeutumiseen (PF06772; P < 0,01), olivat yliedustettuina (Supplemental Table S23).

Sen sijaan supistumistilaa osoittavat geeniperheet osallistuivat pääasiassa kuljetusprosessiin ja energia-aineenvaihduntaan, kuten ABC-transportterit (PF00005; P < 0,01), aminohappopermeaasi (PF00324; P < 0,01) ja ATP-syntaasi (PF00306; P < 0,05) (Supplemental Table S24). Näiden geeniperheiden dynaamisen evoluution lisäksi havaitsimme lisäksi 1077 (~13,57 %) lajispesifistä geeniä O. sinensiksessä (Kuva 2C). Niistä 318 (~29,53 %) geeniä voitiin annotoida toiminnallisesti, ja ne rikastuivat merkittävästi GO-luokissa, jotka liittyvät tärkkelyksen sitoutumiseen (GO: 2001070; P < 0,01), patogeneesiin (GO: 0009405; P < 0.01) ja soluseinän makromolekyylien kataboliseen prosessiin (GO: 0016998; P < 0.01) (Supplemental Table S25) (Supplemental Table S25).

Välttääkseen sienipatogeenien tartunnan hyönteisisisännät tuottavat usein nopeasti runsaasti reaktiivisia happilajeja (ROS) tappaakseen patogeenit suoraan. Vastauksena tähän patogeenit kehittivät evoluution aikana ROS-antioksidanttisen puolustusjärjestelmän, josta ROS-poistoentsyymeinä toimivia peroksidaaseja pidetään yhtenä merkittävimmistä ja olennaisimmista komponenteista24, 25. O. sinensis -lajin laajentuneiden geenien joukossa peroksidaasiaktiivisuus oli yksi voimakkaasti rikastuneista toiminnallisista luokista (lisätaulukko S23). Piilotetun Markovin mallin (HMM) haut paljastivat 42 (~0,53 %) peroksidaasigeeniä O. sinensiksessä, joiden määrä oli huomattavan suurempi kuin C. militarisissa (28) ja hiivassa (21), mikä viittaa siihen, että peroksidaasigeenien kaksinkertainen laajeneminen saattaisi mahdollisesti johtaa vahvaan kykyyn tukea ROS:n detoksifikaatiota O. sinensiksessä (Kuva 3A ja Supplemental Table S26). Näiden 42 peroksidaasigeenin joukossa haloperoksidaasi (hem) on runsain, ja sen osuus kaikista havaituista peroksidaaseista on ~16,67 % (Kuva 3B). Toisin kuin muilla läheisesti sukua olevilla sienilajeilla, joilta tyypillinen 2-kysteiiniperoksiredoksiini puuttuu kokonaan, O. sinensis säilyttää edelleen yhden kopion (Kuva 3B). Aiemmin on osoitettu, että 2-Cys-peroksiredoksiinilla on merkitystä Vibrio vulnificus -bakteerin eriasteiseen hapetusstressiin reagoimisessa 26 . Vertaileva analyysi osoitti, että O. sinensiksessä säilynyt geeni kuuluu Prx1-tyyppiin, jonka on raportoitu olevan toiminnallisesti konservoitunut27 ja ilmentyvän vain silloin, kun solut altistuvat korkeille eksogeenisesti tuotetuille H2O2-pitoisuuksille26.

Toisin kuin kasvipatogeenien (PP) infektiomekanismi, joka vaatii hiilihydraattiaktiivisia entsyymejä (CAZymes) hajottamaan monimutkaista kasvin soluseinää28, hyönteispatogeenit (IP) infektoivat isäntänsä tyypillisesti tunkeutumalla kutikulaariin29. Tämän testaamiseksi vertasimme O. sinensis -kasvintuhoojaa ja neljää muuta hyönteispatogeeniä (M. anisopliae, M. acridum, C. militaris ja B. bassiana) neljän kasvipatogeenin (Fusarium graminearum, Magnaporthe grisea, Grosmannia clavigera ja Botrytis cinerea) kanssa (lisätaulukko S17). Tuloksemme osoittivat, että hyönteispatogeeneilla oli enemmän proteaaseja (keskimäärin 362 IP:ssä vs. 342 PP:ssä; P < 0,43) ja proteiinikinaaseja (keskimäärin 151 IP:ssä vs. 119 PP:ssä; P < 0,0014) hyönteisten kynsinauhan hajottamiseen verrattuna kasvipatogeeneihin (lisätaulukot S27-29). Sitä vastoin kasvipatogeeneilla oli enemmän CAZymejä kuin hyönteispatogeeneilla kasvin soluseinän hajottamiseen (keskimäärin 161 IP:ssä vs. 231 PP:ssä) (lisätaulukot S30-32). Kun kasvipatogeenit jätetään pois, O. sinensiksellä oli huomattavan vähän proteaaseja koodaavia geenejä (260) kuin muilla hyönteispatogeeneilla, kuten M. anisopliae (437), M. acridum (361), C. militaris (355) ja B. bassiana (396). Kuitenkin ~35 % näistä O. sinensis -lajissa luonnehdituista proteaaseista sisältää signaalipeptidiä, joka on todennäköisemmin osallistunut patogeenin ja isännän välisiin vuorovaikutuksiin (lisätaulukot S10 ja S34), mikä on enemmän kuin muissa entomopatogeenisissä sienissä (keskimäärin 20 %). Muiden hyönteispatogeenien tapaan myös useat sellulaasiperheet, mukaan lukien GH7, GH45 ja GH51, vähenivät tai puuttuivat O. sinensiksessä (lisätaulukko S30).

Tarkastelimme myös geeniekspressioprofiileja O. sinensiksen kolmessa kehitysvaiheessa, joissa sienen ja hyönteisen pituussuhteet olivat ~1,20×, ~1,75× ja ~2,20×. Tulokset osoittavat, että yhteensä 411 geeniä ilmentyi eri tavoin (DEG) kolmen kehitysvaiheen välillä (Supplemental Figure S14). Näiden 411 DEG:n toiminnallisessa annotaatiossa havaittiin, että ne olivat pääasiassa mukana sienipatogeenisyydessä, kuten glykosyylihydrolaasien perhe 16 (PF00722; FDR < 0,01), sytokromi P450 (PF00067; FDR < 0,01) ja suurten fasilitaattorien superperhe (PF07690; FDR < 0,05). Lisäksi mitokondrioiden hengitysketjuun liittyviä entsyymejä koodaavat geenit olivat myös toiminnallisesti rikastuneita, kuten NAD-riippuvainen epimeraasi/dehydraasiperhe (PF01370; FDR < 0,01) ja BCS1:n N-terminaalinen domeeni (PF08740; FDR < 0,01) (lisätaulukko S33).

Positiivinen darwinistinen valinta toimii sienipatogeenisuuden liikkeellepanevana voimana

Positiivisella valinnalla on epäilemättä ollut ratkaiseva merkitys Qinghai-Tibetin ylängön korkeissa ympäristöissä elävien moninaisten organismien evoluutiossa, ja monissa fenotyyppisissä ominaisuuksissa on todennäköisesti tällaisia valinnan merkkejä3,4,5. O. sinensiksen ja muiden 12 sienilajin välillä jaetuista 1499:stä korkean varmuuden omaavasta yhden kopion ortologista tunnistettiin O. sinensiksessä 163 positiivisesti valikoitunutta geeniä (PSG) käyttämällä haarautumispaikan likelihood ratio -testiä (LRT; P < 0,05) (Supplemental Table S35). Niistä yksi geeni (OSIN3929; tässä nimetty OsPRX1) on toiminnallisesti sekaantunut peroksidaasiaktiivisuuteen (kuva 3C). Tämä geeni kuuluu peroksiredoksiiniperheeseen, jossa on 1-kysteiini, ja se on erittäin homologinen PRX1:n (YBL064C) kanssa S. cerevisiae 30:ssä. PRX1-geenit S. cerevisiae:ssa ja kahdessa ihmisen patogeenisessä sienessä, A. fumigatusissa ja C. albicansissa, ovat toiminnallisesti konservoituneita ja niitä tarvitaan oksidatiivisen purkauksen detoksifikaatioon isäntäsoluissa31, 32. Erityisesti PRX1:n poistaminen tunnetusta riisipatogeenista Magnaporthe oryzae johti lähes täydelliseen patogeenisuuden häviämiseen, mikä viittaa siihen, että tämä peroksidaasi on avainasemassa isännän ja patogeenin vuorovaikutuksessa27. Silmiinpistävää on, että useiden isännän ja patogeenin vuorovaikutukseen osallistuvien geenien, kuten peroksisomaalisen biogeneesin, proteiinikinaasi- ja metallopeptidaasigeenien, havaittiin myös olevan positiivisen valinnan alaisina (kuva 3C).

Pariutumisjärjestelmän evoluutio

Askoomykeettisissä sienissä pariutumisjärjestelmää kontrolloi tavallisesti pariutumistyyppilokus (mating-type, MAT)33. Genomin sekvensointianalyysissämme havaittiin, että O. sinensis ei omistanut ainoastaan MAT1-2-1-parittelutyyppigeeniä MAT1-2 idiomorfin sisällä, vaan sillä oli myös kolme parittelutyyppigeeniä (eli MAT1-1-1, MAT1-1-2 ja MAT1-1-3) MAT1-1 idiomorfin sisällä (Supplemental Figure S15B). Tämä ominaisuus varmistettiin käyttämällä 31 luonnollisen populaation koko genomin uudelleen sekvensointia lähes koko maantieteelliseltä alueelta, mikä osoittaa, että O. sinensis on todellakin homotallic (Supplemental Figure S15A ja Supplemental Table S36). Ominaisuus eroaa huomattavasti sen läheisesti sukulaisista sienipatogeeneista, kuten Tolypocladium inflatum (MAT1-2)22, C. militaris (MAT1-1)20, B. bassiana (MAT1-1)21, M. anisopliae (MAT1-1)19 ja M. acridum (MAT1-2)19, jotka ovat heterotallikkaita ja joilla on vain yksi parittelutyyppilokus. Samoin kuin tunnetussa homotallisessa kasvipatogeenissä Fusarium graminearum 34, näiden kahden MAT-lokin järjestäytyminen O. sinensis -lajissa paljasti fuusioaseman idiomorfisella genomialueella, joka oli erityisen rikastunut LTR-retrotransponsoneilla. Homotalliksen O. sinensiksen ja heterotalliksen C. militaris -suvun välisen jakautumisen arvioitiin tapahtuneen lähes 174,2 MYA:n aikana (Supplemental Figure S13C), ja se joutui evoluutiohistoriansa aikana moninkertaisten pariutumisjärjestelmän muutosten kohteeksi itsestään epäyhteensopivasta itsestään yhteensopivaksi (Supplemental Figure S15C), mikä muistuttaa filamenttista ascomycete-suvun Neurospora-suvun 35.

Populaatioiden eroavuus leveysasteiden perusteella Qinghain ja Tiibetin ylätasangolla

Tarkistaaksemme koko genomin laajuisia sukulaisuussuhteita ja populaatioiden eroavaisuutta keräsimme ja sekvenssoimme uudelleen 31 O. sinensis -lajin liittymää sen tunnetulta levinneisyysalueelta, mukaan luettuina Qinghain, Sichuanin, Yunnanin ja Gansun maakunnat sekä Tiibetin autonominen alue Qinghain ja Tiibetin ylätasangolla (Täydentävä kuvio S16 ja täydennystaulukko S37). Tuotimme yhteensä 183 miljoonaa parilukua (~36,68 Gb sekvenssejä), joiden keskimääräinen syvyys oli ~10,1 × (raakadata) (Supplemental Table S38). Näistä tiedoista luotiin 816 960 yksittäisnukleotidipolymorfismia (SNP) ja 48 092 tiukkaa indeliä (insertioita ja deletioita) O. sinensis -populaatioiden sukulaisuuden arvioimiseksi (täydentävät kuvat S18-19 ja täydentävä taulukko S39). Suurin osa genomivarianteista (71,1 %) kartoitettiin intergeenisille alueille, ja osa kartoitettiin koodaaville alueille (23,3 %, joka koostui 101 997 synonyymisestä ja 88 224 ei-synonyymisestä SNP:stä, joiden substituutiosuhde oli 0,86) (täydentävä kuva S19 ja täydentävä taulukko S39). SNP-tietokokonaisuuksien avulla muodostettu fylogeneettinen puu jakoi 31 liittymää kolmeen maantieteellisesti erilliseen ryhmään, jotka vaihtelivat matalilta leveysasteilta korkeille leveysasteille (kuva 4A) – havainto vahvistui PCA:n avulla, jossa käytettiin ensimmäistä ja toista ominaisvektoria (kuva 4B ja täydentävä kuva S20A). Oletettujen esipopulaatioiden lukumäärän (K) vaihtelu osoitti, että kun K = 3, kolme erillistä ryhmää ovat yhdenmukaisia PCA:n ja fylogeneettisen rekonstruktion kanssa (kuva 4C ja täydentävä kuva S20B). Joissakin matalilla leveysasteilla sijaitsevaan ryhmään kuuluvissa liitännäislajikkeissa on vahvaa näyttöä sekoittumisesta, ja ne ovat hajanaisempia verrattuna kahteen muuhun ryhmään, mikä viittaa suurempaan geneettiseen monimuotoisuuteen, joka saattaa johtua yhteisistä esi-isien polymorfismeista ja/tai viimeaikaisista introgressiotapahtumista (kuvat 4D,E). Arvioitu populaation erilaistumistilasto (F ST ) näiden kolmen leveyspiiriin perustuvan ryhmän välillä paljasti edelleen matalien leveyspiirien, erityisesti Tiibetin Nyingchin piirikunnasta peräisin olevien populaatioiden, perustavanlaatuisen luonteen, mistä osoituksena oli myös sen huomattavasti suurempi nukleotidien monimuotoisuus (π) ryhmän sisällä ja pienempi populaation erilaistuminen kahteen muuhun korkeilla leveyspiireillä sijaitsevaan ryhmään verrattuna. (Kuva 4C-F).

Tutkimme edelleen geenejä, joihin vaikuttavat eritasoiset SNP-pitoisuudet ja ei-synonyymiset mutaatiot (Supplemental Table S40). Suurimman SNP-pitoisuuden ja/tai ei-synonyymisten mutaatioiden sisältämien 100 tärkeimmän geenin funktionaalinen rikastumisanalyysi osoittaa, että ne osallistuvat pääasiassa sienien sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden aineenvaihduntaan, kuten polyketidisyntaasin dehydraasi (PF14765; FDR < 0,01), KR-domeeni (PF08659; FDR < 0,01) ja kondensaatiodomeeni (PF00668; FDR < 0,01). Myös rasvahappojen biosynteesiin liittyvät funktionaaliset luokat rikastuivat, kuten asyylitransferaasidomeeni (PF00698; FDR < 0,01) ja beetaketoasyylisyntaasi (PF00109 ja PF02801; FDR < 0,01) (lisätaulukot S41-42).