γδ-valinta

γδT-solut syntyvät DN-tymosyyteistä, koska TCRγ- ja δ-ketjujen uudelleenjärjestely tapahtuu DN-vaiheissa . γδ-esisolut, joiden TCRγ- ja δ-ketjut ovat järjestäytyneet uudelleen ennen TCRβ-rekombinaatiota, ilmentävät γδTCR/CD3-kompleksia plasmakalvolla, jossa γδTCR itse-oligomerisoituu esi-TCR:n tavoin ja käynnistää solunsisäisiä signaalireittejä . Tämä γδTCR-signaali käynnistää prosessin, jota kutsutaan nimellä ”γδ-selektio”, joka vahvistaa toimivien TCRγδ-ketjujen syntymisen ja saa solun tunnistamaan, että ”olen γδT-solu” .

Gδ-selektiosignaali käynnistää erilaistumisen CD5- CD24-korkeista γδ-prekursorisoluista CD5+ CD24- mataliksi γδT-soluiksi . Siirtyminen CD5- CD5+ γδT-soluista CD5+ γδT-soluihin on selvästi heikentynyt Syk-puutteisilla hiirillä, kun taas Zap70-puutteisilla hiirillä CD5+ γδT-solujen erilaistuminen on normaalia. Kaksinkertaisesti Zap70/Syk-puutteisilla hiirillä γδT-solujen erilaistuminen pysähtyy kokonaan CD5- esiasteella . Näin ollen γδ-selektio on pääasiassa riippuvainen Syk-välitteisestä signaalista, ja Zap70:llä on vain vähäinen ja tarpeeton rooli tässä prosessissa. Tämä mekanismi on melko samanlainen kuin β-valinnassa. Yksi Sykin kriittinen kohde γδ-selektiosignaalissa on Lat-signalosomi, sillä Lat-puutteisilla hiirillä γδ-selektio estyy täysin ja kypsät γδT-solut puuttuvat kokonaan .

Syk/Zap70-puutteisten hiirten tai Lat-puutteisten hiirtenγδ-esisoluja ei voida erottaa αβT-linjan soluista niiden solupintaproteiinien ilmentymisen perusteella γδTCR:ää lukuun ottamatta, ja ne säilyttävät silti potentiaalinsa erilaistua αβT-soluiksi. Mikä määrää erilaistumisen kohtalon αβT- tai γδT-linjaan esiasteesta? Tätä kysymystä on käsitelty tutkimuksissa, joissa on käytetty γδTCR-siirtogeenisiä hiiriä. Kun γδTCR-signaalia heikennetään joko signalointiproteiinien tai siirtogeenisen γδTCR:n endogeenisten ligandien puutteella, esiasteen soluista syntyi αβT-linjan DP-soluja γδT-linjan solujen kustannuksella . Nämä tulokset viittaavat siihen, että voimakkaampi signaali (todennäköisesti γδTCR-ligandin vuorovaikutuksessa) johtaa sitoutumiseen γδT-soluiksi, kun taas heikompi signaali (todennäköisesti ligandista riippumaton pre-TCR) johtaa αβT-differentiaatioon. Kokeet, joissa käytettiin toista siirtogeenistä hiirikantaa, joka ilmentää γδTCR:ää samalla ligandispesifisyydellä, osoittivat kuitenkin, että γδT-solut pystyivät kypsymään ilman ligandeja. Chien ja työtoverit käyttivät ligandispesifisen γδT-solupopulaation tunnistamiseksi tetramerivärjäysmenetelmää tutkiakseen endogeenisten γδTCR-ligandien merkitystä muissa kuin siirtogeenisissä hiirissä. Tulokset osoittivat selvästi, että ligandispesifisten γδT-solujen määrä oli vertailukelpoinen ligandipitoisten ja -puutteisten hiirten välillä, mikä viittaa siihen, että suurin osa γδT-soluista ei ole kohdannut ligandeja kateenkorvan erilaistumisen aikana . Kirjoittajat toimittivat myös todisteita siitä, että jotkin γδTCR:t voivat signaloida ligandista riippumattomasti . Nämä havainnot ovat ilmeisesti ristiriidassa aiemman mallin kanssa, jonka mukaan γδT-linjan sitoutuminen edellyttää γδTCR-ligandien vuorovaikutusta. Koska polyklonaaliset γδT-solut, jotka reagoivat tiettyihin eksogeenisiin ligandeihin, erilaistuvat ja kypsyvät toiminnallisesti kateenkorvassa, on todennäköistä, että tietyissä γδTCR-siirtogeenisissä hiirilinjoissa tehdyt havainnot eivät kuvasta enemmistöä γδT-soluista, joilla on polyklonaaliset γδTCR:t.

Tarkastellaksemme γδ-selektiosignaalin vaikutusta αβT/γδT-erilaistumiseen hyödynsimme Lat-puutteisia hiiriä, joissa γδT-solujen erilaistuminen pysähtyy CD5- esiasteella. γδTCR+-esiastesolut puhdistettiin aikuisista Lat-puutteellisista hiiristä, infektoitiin Latia ilmentävillä retroviruksilla ja kasvatettiin stroomasolumonolyyreillä (kuva 2a). Tämä koe mahdollistaa solujen fenotyypin suoran arvioinnin ennen γδ-valintaa ja sen jälkeen ligandittomissa olosuhteissa. Verrattuna transduktoimattomiin kontrollisoluihin Latia ilmentävät γδT-solut indusoivat selvästi CD5:n pintaekspressiota (kuva 2b) sekä γδT-solujen tunnusgeenien (Tcrd, Egr3, Runx3 ja Bcl-2) mRNA-ekspressiota (kuva 2b), ja niiden geenien transkription transkriptio, jotka liittyvät DN-alkuisiin DN-alkuisiin soluihin ja αβT-alkuisiin soluihin (Rag1, Rag2 ja Ptcra), hävisi kokonaan (kuva 2c). Nämä tulokset osoittavat, että γδTCR-signaali sekä ohjaa erilaistumista γδT-linjan suuntaan että tukahduttaa erilaistumista αβT-linjan suuntaan ligandista riippumattomalla tavalla.

Yhteenvetona voidaan todeta, että vaikka mekanismit, joiden avulla pre-TCR ja γδTCR ohjaavat erilaistumisprosesseja αβT- ja γδT-linjoihin, ovat edelleen vaikeasti selvitettävissä (ja niistä käydään keskustelua), on todennäköistä, että γδ-selektio ei ainakaan suurimmalla osalla luonnollisesti syntyneistä γδT-soluista ole riippuvainen kateenkorvan cognatista γδTCR:n ligandista.

γδTCR-signaalin voimakkuus määrää γδT17/γδT1-differentioitumisen

Sykin ja Zap70:n ilmentymistä säädellään käänteisesti sekä αβT- että γδT-linjojen kehityksen aikana: γδT-solut, jotka ovat läpäisseet γδ-selektion, ilmentävät suuria määriä Zap70:tä sekä γδTCR/CD3-komplekseja, ja ne voivat reagoida endogeenisiin ligandeihin, jos niitä tarjotaan kateenkorvassa. Tällä hetkellä tiedetään, että toisin kuin αβT-solut, γδT-solut eivät käy läpi ligandien aiheuttamaa positiivista valikoitumista tai klonaalista poistumista kateenkorvassa. Useissa tutkimuksissa on esitetty, että γδTCR-ligandien vuorovaikutus kateenkorvassa sen sijaan ohjaa γδT-solujen efektoritoimintaa.

Käyttämällä ei-klassisille MHC-luokan I molekyyleille T10 ja T22 reaktiivisen γδT-solupopulaation tetramerivärjäystä Chienin ryhmä havaitsi, että antigeeni-naiviset γδT-solut, jotka kehittyivät ilman ligandeja, tuottivat ensisijaisesti IL-17:ää, kun taas antigeenikokemusta omaavat γδT-solut, jotka kehittyivät ligandien läsnä ollessa, tuottivat pääasiassa IFNγ:tä. Tässä tutkimuksessa esitettiin ensimmäisen kerran ajatus siitä, että ligandien indusoima vahva γδTCR-signaali ja heikko γδTCR-signaali indusoivat vastaavasti γδT1- ja γδT17-soluja. Tuoreessa tutkimuksessa, jossa käytettiin hiljattain luotuja T10/T22-puutteellisia hiiriä, raportoitiin pääosin samoja tuloksia, mikä tukee tätä ”signaalin voimakkuusmallia” . Tätä mallia on tuettu edelleen muissa tutkimuksissa. Vγ5Vδ1 γδT-solujen kateenkorvan kypsyminen ja efektori-erilaistuminen edellyttävät Skint1:tä (ja todennäköisesti muitakin Skint-perheen proteiineja), joka on Vγ5Vδ1 TCR:n oletettu costimulatorinen proteiini . Skint1:n puuttuessa Vγ5Vδ1 γδT-solut ohjautuvat virheellisesti γδΤ17-solujen fenotyyppiin γδΤ1-solujen fenotyypin kustannuksella . Lisäksi γδT1-solujen kehittyminen edellyttää myös kustannustimulaatiota CD27:n kautta, joka on TNF-reseptorin superperheen proteiini, joka ilmentyy γδT1-soluissa mutta ei γδT17-soluissa . Hiljattain Penningtonin ryhmä tunnisti kateenkorvan bipotentteja γδT-soluja (CD24lo CD44lo CD45RBlo), joista voi syntyä sekä γδT17-soluja että γδT1-soluja. Sikiön kateenkorvan elinviljelyssä γδT17-solujen kehitystä estivät voimakkaat TCR-signaalit, jotka indusoitiin stimuloimalla anti-TCRδ- tai anti-CD3ε-vasta-aineilla, mutta nämä vaikutukset kumottiin MEK/ERK-reitin farmakologisella estolla. Nämä tiedot tarjoavat suoraa näyttöä sen ajatuksen tueksi, että γδTCR-signaalin voimakkuus on kriittinen tekijä γδT-solujen efektoritoiminnalle.

Transkriptiotasolla voimakas γδTCR-signaali indusoi γδT1:een liittyvien transkriptiosäätäjien, kuten Egr2:n, Egr3:n ja Id3:n ilmentymistä, mikä johtaa γδT1-solujen kohtaloon . Id3 estää γδT17-soluaseman omaksumisen estämällä HEB:n (jota koodaa Tcf12) välittämän transkriptiosäätelyn . HEB voi sitoutua suoraan Sox4:n ja Sox13:n transkriptionaalisten aloituskohtien yläjuoksulle ja edistää niiden ilmentymistä. Näitä γδT17-assosioituneita transkriptiotekijöitä tarvitaan välttämättömän transkriptiotekijän RORγt (jota koodaa Rorc) ja signaaliproteiini Blk:n ilmentymiseen. Nämä seikat huomioon ottaen TCR-signaalin voimakkuusmalli osoittaa selvästi mekanismit, joilla TCR-signaali kontrolloi γδT-solujen efektoritoimintaa.

Sarja tutkimuksia on kuitenkin osoittanut TCR-signaalimolekyylien geneettisen ablaation vaikutuksen γδT-solujen efektoritoimintaan, mikä kyseenalaistaa ajatuksen siitä, että γδTCR-signaalin voimakkuus yksinään määrittää γδT17/γδT1-erilaistumisen kohtalon. Zap70 W163C -mutanttihiirillä Vγ6+ γδT17-solujen kehitys katoaa kokonaan, mutta γδT1-solujen kehitys on normaalia, kun taas TCR-signaalit vaimenevat näissä hiirissä . Toinen Silva-Santosin ja työtovereiden tutkimus osoitti, että CD3δ:n ja CD3γ:n (CD3DH) haploinsidenssi on riittämätön CD3δ:lle ja CD3γ:lle (CD3DH), jolloin γδTCR/CD3-kompleksien solupintaekspressio oli vähäisempää ja γδTCR-signalointi heikentynyt, Vγ6+ γδT17-solujen sekä γδT1-solujen mutta ei Vγ4+ γδT17-solujen kateenkorvan kehitys väheni huomattavasti, mikä osoittaa, että γδT17-alaryhmät vaativat erilaista γδTCR-signaalin voimakkuutta kehittyäkseen. Vaikka αβT-solujen kehitys ja αβTCR-signaalinsiirto eivät vaikuttaneet CD3DH-hiirillä, tämä hiirikanta on toistaiseksi ainoa eläinmalli, jossa γδTCR-signaalinsiirron spesifinen estäminen on osoitettu. On edelleen epäselvää, miksi γδT-solut kärsivät erityisesti CD3DH-hiirissä, mutta on todennäköistä, että TCR-CD3-kompleksien αβT- ja γδT-solujen erilainen koostumus selittää CD3DH-hiirten ainutlaatuisen fenotyypin. Tässä yhteydessä on huomattava, että hiirillä, joilla on CD3ε C80G -mutaatio, joka ei kykene indusoimaan konformaatiomuutoksia TCR:ssä, myös γδT17-solujen kehitys on heikentynyt, mutta γδT1-solujen kehitys on normaalia.

Syk:iä tarvitaan γδT17-solujen erilaistumiseen

Viime aikoina raportoimme uudesta säätelymekanismista, jonka avulla γδTCR:n proksimaaliset kinaasit Syk ja Zap70 kontrolloivat eri tavoin γδT17-solujen indukatiota . Syk-puutteisilla hiirillä γδT17-solut (sekä Vγ4+- että Vγ6+-alaryhmät) katoavat kokonaan kateenkorvassa. Huomattavaa on, että Zap70:n pakotettu ilmentäminen Syk-puutteellisissa T-progenitorisoluissa ei onnistunut palauttamaan γδT17-solujen sukupolvea, mikä viittaa Sykin ei-redundanttiin rooliin γδT17:n erilaistumisessa. Koska Syk- mutta ei Zap70-puutteelliset γδT-solut vähentävät merkittävästi γδTCR-stimulaation indusoimaa Akt-fosforylaatiota, on osoitettu, että Syk välittää γδTCR:n indusoimaa PI3K-Akt-reitin aktivaatiota. PI3K-puutteellisilla hiirillä (p110γ-/- p110δ-/-) γδT17-solujen kehitys estyy täysin, mutta ne eivät vaikuta γδ-selektioon (CD5:n nouseva säätely) tai γδT1:n kehitykseen. PI3K:n estämisen osoitettiin vähentävän γδT17:ään liittyvien transkriptiotekijöiden (Rorc, Sox13 ja Sox4) ilmentymistä, mikä viittaa PI3K-Akt-reitin ratkaisevaan rooliin γδT17:n erilaistumisohjelman indusoimisessa. Aiemmassa raportissa osoitettiin, että kinaasi-inaktiivisilla PI3Kδ- tai PI3Kγ-puutteisilla hiirillä perifeeristen γδT17-solujen määrä vähenee huomattavasti ja γδT17-riippuvainen tulehdus paranee. PI3K-Akt-reittiä tarvitaan myös IL-17:ää tuottavien αβT-solujen (Th17) erilaistumiseen, mikä viittaa siihen, että tämä signaalireitti on αβT- ja γδT-linjojen yhteinen säätelymekanismi IL-17:ää tuottavien proinflammatoristen alaryhmien tuottamiseksi.

γδTCR:n indusoima PI3K-Akt-reitin aktivoituminen riippuu Syk:stä mutta ei Lat:sta, mikä viittaa siihen, että Syk ohjaa γδT17-erilaistumista indusoivaa PI3K-Akt-reittiä Lat-riippuvaisen, γδ-erilaistumista indusoivan valtavirtaisen signaalireitin lisäksi . On epäselvää, aktivoiko Syk PI3K/Akt-reittiä γδT-soluissa suoran vuorovaikutuksen kautta vai epäsuorasti. Aiemmassa tutkimuksessa raportoitiin, että Rasgrp1-puutteellisilla hiirillä on γδT-solujen efektorifenotyyppi, joka on samanlainen kuin PI3K-puutteellisilla hiirillä (eli γδT17-solujen menetys ja γδT1-solujen lisääntyminen) . Koska Rasgrp1 voi toimia PI3K/Akt-reitin ylävirran aktivaattorina αβTCR-signaloinnissa, on todennäköistä, että Rasgrp1 välittää signaaleja γδTCR:ltä PI3K:lle γδT17-erilaistumisen indusoimiseksi.

GδT17-solujen ensisijaista häviämistä raportoitiin myös hiirillä, joilla oli puutos Blk:sta, Src-perheen kinaasista, joka ilmentyy sekä γδT-soluissa että B-soluissa, vaikka sen funktiota γδTCR-signaalin transduktiossa ei tunneta .

Zap70 kontrolloi tiettyjä γδT-solujen osajoukkoja

Olemme myös osoittaneet Zap70:n roolin γδT-solujen kateenkorvan erilaistumisessa . Zap70-puutteellisilla hiirillä esiintyy merkittävää Vγ6+-solujen vähenemistä, joista suurin osa on γδT17-soluja, mutta ne eivät vaikuta muiden γδT-solujen, mukaan lukien Vγ1+- sekä Vγ4+-alaryhmien, kehitykseen. Zap70-proteiinin ilmentymistaso olikin γδT-solujen joukossa korkein Vγ6+-alaryhmässä. Koska CD5:n ilmentyminen oli vähäisempää Zap70-puutteellisissa Vγ6+-soluissa kuin kontrollisoluissa, Zap70:tä tarvitaan todennäköisesti Vγ6+-solujen kateenkorvan kypsymiseen. Kokeissamme Zap70-puutteisilla hiirillä Vγ4+-solujen kateenkorvan erilaistuminen oli normaalia, mukaan lukien γδT17-alaryhmä, mikä on ristiriidassa aiemman raportin kanssa, jossa hypomorfinen Zap70-mutaatio aiheutti kateenkorvan Vγ4+ γδT17-solujen vähenemisen. Tämä ristiriita voi johtua kahdessa tutkimuksessa käytetyistä erilaisista hiiristä (Haydayn ryhmä käytti hypomorfisia Zap70-mutaatiohiiriä BALB/c-taustalla, kun taas me käytimme täysin Zap70-puutteellisia hiiriä C57BL/6-taustalla). Lisäksi Zap70-puutteisilla hiirillä esiintyi merkittävää vähenemistä perifeerisissä Vγ4+-soluissa, jotka sisälsivät sekä γδT17- että γδT1-alaryhmät, mutta joiden Vγ1+-solut eivät olleet heikentyneet. Näin ollen, toisin kuin Zap70:n olennainen rooli αβT-solujen kehityksessä, Zap70:n vaatimus rajoittuu kateenkorvan Vγ6+-solujen kypsymiseen ja perifeeristen Vγ4+-solujen ylläpitoon.

Havaintomme Zap70:n ja Sykin erilaisista rooleista saattavat antaa uusia johtolankoja γδTCR:n signaalinvälityksen mekanismien ja γδT-solujen kehityksen ymmärtämiseen. Zap70:tä tarvitaan αβTCR-signalointiin ja γδTCR-signalointiin tietyissä γδT-solujen alaryhmissä. αβT-soluissa Zap70:n aktivoituminen on riippuvainen Lck:stä, joka kytkeytyy CD4- tai CD8-ydinseptoreihin, jotka sitoutuvat pMHC:hen antigeenejä esittelevien solujen pinnalla . Näin ollen ehdotetaan, että Lck-Zap70 on signalointiakseli, joka on erikoistunut solu-solukontaktiin perustuvaan antigeenitunnistukseen; vaikka γδT-solujen tapauksessa on edelleen epäselvää, miten Zap70 aktivoituu CD4- ja CD8-ekspression puuttumisesta huolimatta. Sitä vastoin Syk liittyy monenlaisiin immunoreseptoreihin, kuten pre-TCR, γδTCR, BCR ja FcR . Koska Syk pystyy fosforyloimaan ITAM:eja ja myöhempiä kohteita Src-perheen kinaaseista, kuten Lck:stä, riippumatta, nämä reseptorit voivat aktivoitua ligandista riippumattomasti tai sitoutuessaan erilaisiin liukoisiin ja solupinnan antigeeneihin. Näin ollen Sykin tai Zap70:n käyttö immunoreseptorin signaloinnissa voi sanella, miten reseptori tunnistaa antigeenin. Sykin ilmentäminen Zap70:n sijasta teki αβT-soluista kykeneviä reagoimaan liukoisen anti-CD3-vasta-aineen stimulaatioon, kun taas normaalit αβT-solut reagoivat vain multimerisoituneisiin anti-CD3-vasta-aineisiin, jotka jäljittelevät vuorovaikutusta solupinnan pMHC:n kanssa. Nämä havainnot saivat meidät esittämään hypoteesin, että lymfosyyttien käyttämä antigeenin tunnistustapa saattaa määräytyä paitsi niiden reseptorin sinänsä myös Syk-perheen kinaasien erilaisen käytön perusteella. Tämän ajatuksen perusteella ennustamme, että on olemassa endogeenisia solupinnan γδTCR-ligandeja, joita tarvitaan Vγ6+-solujen kateenkorvan kypsymiseen sekä Vγ4+-solujen perifeeriseen ylläpitoon, ja että Vγ1+-solut eivät tarvitse solupinnan γδTCR-ligandeja kehittyäkseen ja/tai ylläpitääkseen.

γδTCR:stä riippumattomat ja -riippuvaiset prosessit γδT17-solujen induktiossa

Äskettäin julkaistussa raportissa osoitettiin tyylikkäästi, että γδT17-solut syntyvät progenitorista, joka eroaa muista γδT-solujen osajoukoista . Raportoitiin, että sikiöperäisiä, intrathymian sisäisiä progenitoreita, jotka ilmentävät korkeita Sox13-pitoisuuksia, tunnistettiin populaatiossa, joka oli aiemmin luokiteltu DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) -tymosyyteiksi. Nämä Sox13+-progenitaattorit synnyttivät ensisijaisesti γδT17-soluja rekonstruoidussa sikiön kateenkorvassa, kun taas muut DN2-populaatioon kuuluvat progenitaattorit eivät synny. Mikä tärkeintä, Sox13+-alkueläimet olivat havaittavissa ja niiden γδT17-linjaohjelmat olivat ehjiä TCRδ-puutteellisissa tai Rag-puutteellisissa hiirissä, mikä osoittaa, että γδT17-linjan kohtalo on ”esiohjelmoitu” solun sisäisen, γδTCR:stä riippumattoman mekanismin avulla. Aiemmassa raportissa kuitenkin osoitettiin, että γδT17-solut voivat kehittyä DN2-vaiheesta (CD44+CD25+c-kithi), kun niitä viljellään yhdessä Notch-ligandia ilmentävien stroomasolujen monokerroksessa. Voi siis olla tarpeen määritellä uudelleen erilaistumisvaiheet ja progenitori-laskeutumissuhteet γδT-solujen kehityksessä.

Kuvassa 3 on yhteenveto γδT-solujen sekä αβT-solujen erilaistumisprosesseista, ja siinä korostetaan eroja αβ/γδTCR-signaalien ja Syk-perheen kinaasien vaatimuksissa. Erilaistumisen varhaisia vaiheita, eli β-valintaa αβT-solulinjaksi ja γδ-valintaa γδT-solulinjaksi, ohjaa ligandista riippumaton pre-TCR- tai γδTCR-signalointi, joka toimii tarkastuspisteenä toimivaa TCRβ-ketjua tai γδTCR-ketjua ilmentäville soluille. Nämä ligandista riippumattomat reseptorisignaalit käynnistää Syk, joka ilmentyy DN-tymosyyteissä, mukaan lukien γδT-esiasteet. γδT-solulinjassa Sykin välittämää γδTCR-signaalia tarvitaan myös γδT17-solujen erilaistumisen käynnistämiseen PI3K-reitin aktivoinnin kautta. Sekä β- että γδ-valinnan aikana Sykin ja Zap70:n ilmentymistä säädellään käänteisesti: Syk on alasreguloitunut, kun taas Zap70 on ylösreguloitunut pre-TCR- tai γδTCR-signaalin yhteydessä. Näin ollen αβT-linjan erilaistumisen myöhempi vaihe riippuu Zap70-välitteisestä αβTCR-signaloinnista, jonka ansiosta DP-kymosyytit tunnistavat pMHC:n TEC:ien pinnalla, jotta ne valikoituvat positiivisesti tai negatiivisesti αβTCR-pMHC-vuorovaikutuksen voimakkuuden mukaan. Sen sijaan Zap70-välitteinen γδTCR-signalointi vastauksena endogeenisiin ligandeihin määrittää γδT-solujen efektoritoiminnan: voimakas signaali indusoi γδT1:n, kun taas heikko/ei signaalia indusoi γδT17:n.

.