Protrombiinilla on keskeinen rooli veren hyytymisessä (kuva 1, 2). Sen toiminnalliset ominaisuudet liittyvät gamma-karboksiglutamyyli (Gla)-jäämien esiintymiseen, jotka ovat tulosta K-vitamiinista riippuvaisesta kymmenen spesifisen glutamyylijäännöksen posttranslationaalisesta karboksylaatiosta (kuvat 3, 4). Naudanlihaa koskevissa tutkimuksissani (esim. tutkiessani metalli-ionien sitoutumisen ja proteiinin toiminnan välistä yhteyttä ””””””””protrombinaasikompleksissa””””””””) erotan toisistaan ligandoitumisen ja Gla-jäämien myöhemmän konformaatiomuutoksen normaalissa fysiologisessa prosessissa. Näissä puitteissa olen aiemmin eristänyt ja karakterisoinut kuusi erilaista Gla-puutteista (0-, 1-, 2-, 3-, 5- ja 7-Gla) protrombiinivarianttia. Kukin niistä tuotti trombiinia kvantitatiivisesti, mutta selvästi hitaammin (korkea K/m) kuin 10-Gla-protrombiini, koska Ca/2+- ja fosfolipidisitoutuminen väheni jyrkästi verrattuna normaaliin 10-Gla-protrombiiniin. Seitsemän ja vähemmän glaa:n variantit osoittivat vain 3 prosenttia normaalista protrombiinin aktiivisuudesta, kun mitattiin niiden kykyä kiihdyttää protrombiini- ja tekijä VII-puutteisen plasman hyytymistä. Vasta eristetyillä 8- ja 9-Gla-protrombiineilla on 18 ja 75 % normaalista aktiivisuudesta, ja ne muodostavat siirtymän 7- ja 10-Gla-protrombiinien välille. 8- ja 9-Gla-varianttien eristäminen tuli mahdolliseksi hyödyntämällä monoklonaalisia vasta-aineita (McAb) protrombiinin Ca2+-stabiloitua rakennetta vastaan (Ca II Ab) immunoaffiniteettikromatografiaa varten. Polyklonaalisilla ja monoklonaalisilla Ca II Ab:lla tekemäni immunokemialliset tutkimukset ovat osoittaneet, että ne (polyklonaaliset) eivät ole spesifisiä normaalille protrombiinille, koska ne reagoivat ristiin 7-, 8- ja (erityisesti) 9-Gla-varianttien kanssa. Lisäksi 5- ja 7-Gla-protrombiinia koskevat alustavat tietoni viittaavat siihen, että Glu-asemat 15 ja 17 eivät ole muuntuneet ja että valikoivat asemat (jäännökset 7,8,20,30,33) saattavat olla ensisijaisesti karboksyloituneet. Ehdotettu tutkimus paljastaa, ovatko Gla-puutteiset protrombiinit todella valikoivasti puutteellisia, mikä osoittaa ””””””””in vivo”””””””” Glu-jäämien karboksylaatiojärjestyksen. Asiantuntemukseni sen kuvaamisessa, miten Gla-jäämien sijainti ja/tai lukumäärä vaikuttavat protrombiinin ja Gla-pitoisen Fragment 1:n toiminnallisiin, fysikaalis-kemiallisiin (konformaatio-) ja immunokemiallisiin ominaisuuksiin, muodostaa perustan ihmismateriaalien eristämiselle sekä perus- että kliinisiä tutkimuksia varten. Eristän normaaleja ja tärkeimpiä Gla-puutteellisia protrombiineja. Jälkimmäiset jaetaan sitten kahteen (tai useampaan) ryhmään niiden fysiologisen aktiivisuuden mukaan. Tavoitteena on seurata varfariinihoitoa saavien potilaiden plasmasta normaaleja, 9-Gla-protrombiineja (jos tämä on ainoa funktionaalisesti aktiivinen protrombiini) ja kokonaisprotrombiineja (normaalit ja Gla-puutteelliset protrombiinit) immunomäärityksillä, joissa käytetään spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, jotta voidaan arvioida näiden potilaiden hemostaattista tilaa.
Tarkoituksena on selvittää, miksi joillakin potilailla esiintyy tromboottisia jaksoja, kun taas toiset ovat alttiimpia verenvuodoille, vaikka heidän plasmansa protrombiinin bioaktiivisuus säilyy kliinisesti hyväksyttävällä tasolla. Lisäksi Gla-puutteelliset protrombiinit voivat tarjota toisen merkkiaineen maksan toimintahäiriölle.