Röntgensäteiden vuorovaikutus kiteen elektronien kanssa synnyttää diffraktiokuvion, joka matemaattisesti on elektronitiheysjakauman Fourier-muunnos. Röntgensäteilyn mittaamiseen käytettävät ilmaisimet pystyvät kuitenkin mittaamaan vain diffraktoituneen röntgensäteilyn amplitudin; Fourier-muunnoksen käyttämiseen ja elektronitiheysjakauman löytämiseen tarvittavia vaihesiirtymiä ei voida mitata suoraan tällä menetelmällä. Tämä tunnetaan fysiikan piirissä ”vaiheongelmana”. Yksinkertaisemmin sanottuna vaiheita ei voida löytää röntgensäteilyn mitatuista amplitudeista. Elektronitiheyskartan saamiseksi on tehtävä muita ekstrapolointeja ja lisäkokeita. Monesti olemassa olevat tiedot yhdisteen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista voivat auttaa, kun tiheyskartta on huono. Toinen menetelmä, joka tunnetaan nimellä Patterson-synteesi, on erittäin käyttökelpoinen, kun halutaan saada selville alustava arvio faaseista, ja se on erittäin käyttökelpoinen alkuvaiheessa proteiinien rakenteen määrittämiseksi, kun faaseja ei tunneta. Ongelmaa voidaan yksinkertaistaa etsimällä atomi, yleensä raskasmetalli, käyttämällä Patterson-synteesiä ja käyttämällä sitten kyseisen atomin sijaintia alkuvaiheiden arvioimiseen ja elektronitiheyden alkukartan laskemiseen, joka voi edelleen auttaa muiden atomien sijainnin mallintamisessa ja parantaa vaiheiden arviointia entisestään. Toinen menetelmä on nimeltään Molecular Replacement; sillä paikannetaan proteiinirakenteen sijainti solussa. Molekyylikorvausmenetelmän lisäksi vaiheongelma voidaan ratkaista myös isomorfisella korvausmenetelmällä, usean aallonpituuden anomaalisella diffraktiomenetelmällä, yhden aallonpituuden anomaalisella diffraktiomenetelmällä ja suorilla menetelmillä.

MolekyylikorvausMuokkaa

Faasiongelma voidaan ratkaista, kun on olemassa atomimalli, joka osaa laskea vaiheet. Malli voidaan saada, jos siihen liittyvä proteiinirakenne tunnetaan. Tämän atomimallin rakentamiseksi on kuitenkin määritettävä mallin orientaatio ja sijainti uudessa yksikkösolussa. Tällöin tulee kyseeseen tekniikka, molekyylikorvaus (tai MR).

Molekyylikorvaus, joka tunnetaan myös nimellä MR, on menetelmä, jolla ratkaistaan vaiheongelmia röntgenkristallografiassa. MR paikallistaa proteiinirakenteen orientaation ja sijainnin yksikkösolullaan, jonka proteiinirakenne on homologinen määritettävän tuntemattoman proteiinirakenteen kanssa. Saatujen vaiheiden avulla voidaan tuottaa elektronitiheyskarttoja ja auttaa tuottamaan laskennallisia intensiteettejä proteiinirakennemallin sijainnista röntgenkristallografiakokeesta havaittuihin rakenteisiin.

MR-menetelmä on tehokas myös makromolekyylien kiderakenteiden ratkaisemisessa. Tämä menetelmä vaatii vähemmän aikaa ja vaivaa rakenteen määrittämiseen, koska raskasatomijohdannaisia ja tietojen keräämistä ei tarvitse valmistella. Menetelmä on suoraviivainen ja mallin rakentaminen yksinkertaistuu, koska siinä ei tarvita ketjujen jäljittämistä.

Tämä menetelmä koostuu kahdesta vaiheesta:

1. rotaatiohaku homologisen mallin orientoimiseksi yksikkösolussa tai kohde
2. translaatiokohde, johon uusi orientoitu malli sijoitetaan yksikkösolussa

Patterson-pohjainen (molekyylikorvaus)muokkaus

Patterson-kartat ovat atomien välisiä vektorikarttoja, jotka sisältävät piikkejä kullekin yksikkösolussa olevalle toisiinsa yhteydessä olevalle atomille. Jos Patterson-kartat on luotu elektronitiheyskartoista saatujen tietojen perusteella, kahden Patterson-kartan pitäisi olla läheisessä suhteessa toisiinsa vain, jos malli on oikein suunnattu ja sijoitettu oikeaan paikkaan. Näin voimme päätellä tietoa tuntemattoman proteiinirakenteen sijainnista soluineen. Molekyylikorvauksessa on kuitenkin ongelma, sillä siinä on kuusi ulottuvuutta ja kolme parametria, joilla määritetään orientaatio ja sijainti. Patterson-karttojen avulla se voidaan jakaa parametrien osajoukkoihin, jotta voidaan tarkastella jokaista osaa erikseen.

RotaatiofunktioEdit

Rotaatiofunktiolla on molekyylinsisäiset vektorit, jotka riippuvat vain molekyylin orientaatiosta, eivät sen sijainnista, koska vaikka molekyyliä käännetään yksikkösolussa, kaikki atomit siirtyvät saman verran, mutta atomien väliset vektorit ovat samat. Tuntemattoman proteiinirakenteen Patterson-karttaa verrataan homologiseen tunnettuun proteiinirakenteeseen eri orientaatioissa

Classic Rotation FunctionEdit

Orientoitumisen löytämiseksi määritetään kiertoakseli ja kiertokulma kyseisen akselin ympäri. Akselin (vektori pallon keskipisteestä pallon pinnalla olevaan pisteeseen) määrittämiseen tarvitaan kaksi parametria. Kiertoakseli alkaa z-akselin suuntaisesti ja sitä kierretään y-akselin ympäri kulmalla ᶱ, sitten objekti kiertyy z-akselin ympäri kulmalla ᶲ ja lopuksi se kiertyy kiertoakselin ympäri kulmalla ᵠ. Nämä määrittelevät pisteen yksikköpallon pinnalla.

Nopea rotaatiofunktioMuokkaa

Rotaatiofunktio voidaan laskea vertailemalla kahta Patterson-karttaa tai niiden huippuja. Kiertofunktio voidaan laskea paljon nopeammin Fourier-muunnoksilla vain, jos Pattersonit ilmaistaisiin palloharmonisina.

Suora kiertofunktioMuokkaa

Suorassa kiertofunktiossa proteiinirakenne voidaan sijoittaa tuntemattoman rakenteen yksikkösoluun ja orientoidun molekyylin Pattersonia verrataan koko tuntemattoman rakenteen Pattersoniin.

KäännösfunktioEdit

Kun tunnetun rakenteen orientaatio tunnetaan, sen malli (elektronitiheyskartta) voidaan orientoida rakennekertoimien laskemiseksi, jolloin korrelaatiofunktiota käytetään määrittämään vektori, jolla malli käännetään homologisen mallin päälle epäsymmetrisessä yksikössä.

Kun proteiinirakenteesta on oikein orientoidut ja käännetyt vaiheistusmallit, on riittävän tarkkaa johtaa johdetuista vaiheista elektronitiheyskartat. Elektronitiheyskarttojen avulla voidaan rakentaa ja tarkentaa tuntemattoman rakenteen mallia.

Multiwavelength Anomalous DiffractionEdit

X-säteitä tuotetaan suurissa koneissa, joita kutsutaan synkrotroneiksi. Synkrotronit kiihdyttävät elektronit lähes valonnopeuteen ja kuljettavat ne suuren, onton metallisen monikulmion renkaan läpi. Jokaisessa kulmassa magneetit taivuttavat elektronivirtaa, mikä aiheuttaa energiaa sähkömagneettisen säteilyn muodossa. Koska elektronit liikkuvat valon nopeudella, ne säteilevät suurienergistä röntgensäteilyä.

Synkrotronien käytön etuna on se, että tutkijoiden ei tarvitse kasvattaa useita versioita jokaisesta kiteytyneestä molekyylistä, vaan he voivat kasvattaa vain yhden tyyppisen kiteen, joka sisältää seleeniä. Sen jälkeen heillä on mahdollisuus virittää aallonpituus vastaamaan seleenin kemiallisia ominaisuuksia. Tämä tekniikka tunnetaan nimellä Multiwavelength Anomalous Diffraction. Tämän jälkeen kiteitä pommitetaan useita kertoja eripituisilla aallonpituuksilla, ja lopulta syntyy diffraktiokuvio, jonka avulla tutkijat voivat määrittää seleeniatomien sijainnin. Tätä sijaintia voidaan käyttää vertailukohtana tai markkerina muun rakenteen määrittämisessä. Tämän hyödyn ansiosta tutkijat voivat kerätä tietojaan paljon nopeammin.

Isomorfinen korvausmenetelmäEdit

Tässä menetelmässä verrataan röntgendiffraktiokuvioita alkuperäisen proteiinikiteen ja samantyyppisen kiteen välillä, johon on lisätty vähintään yksi atomi, jolla on korkea atomiluku. Menetelmää käytti pienten molekyylien ja lopulta hemoglobiinin rakenteen määrittämiseen Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Täydellinen isomorfismi on kyseessä silloin, kun alkuperäisellä kiteellä ja sen johdannaisella on täsmälleen sama proteiinin konformaatio, molekyylien sijainti ja orientaatio sekä yksikkösoluparametrit. Ainoa ero, joka kiteellä ja sen johdannaisella on täydellisessä isomorfismissa, on intensiteettierot, jotka johtuvat raskaiden atomien lisäämisestä johdannaisessa. Nämä erot voidaan tunnistaa manuaalisesti tai automaattisella Patterson-hakumenettelyllä, kuten SIR 2002, SHELXD, nB ja ACORN, ja nämä tiedot ovat tärkeitä proteiinin vaihekulmien määrittämiseksi. Täydellistä isomorfismia tuskin kuitenkaan esiintyy, koska solujen mitat muuttuvat. Proteiinille, jossa on raskas atomi, sen siedettävä solun ulottuvuuden muutos on dmin/4, sillä dmin on resoluutioraja. Myös muut tekijät, kuten rotaatio, vaikuttavat osaltaan epäisomorfismiin.

MenetelmätMuokkaa

1. Valmistetaan muutama johdannainen kiderakenteisesta proteiinista. Mittaa sitten solun ulottuvuus isomorfisuuden tarkistamiseksi.
2. Kerää röntgen-intensiteettidata alkuperäisestä proteiinista ja sen johdannaisesta.
3. Sovella Patterson-funktiota raskaan atomin koordinaattien määrittämiseksi.
4. Parametrisoi raskaan atomin parametrit ja laske proteiinin faasikulma.
5. Laskekaa proteiinin elektronitiheys.

Johdannaiset valmistetaan kahdella eri menetelmällä. Suositeltava menetelmä on liottaa proteiinikide liuoksessa, joka on koostumukseltaan identtinen emäliuoksen kanssa, mutta jossa saostuskonsentraatiota on hieman nostettu. Toinen menetelmä on yhteiskiteytys, mutta sitä ei käytetä yleisesti, koska kide ei kasva tai kasvaa ei-isomorfisesti. Liotusmenetelmä riippuu siitä, kuinka laajoja kiteen huokoset ovat. Huokosten tulee olla riittävän leveät, jotta reagenssi diffundoituu kiteeseen ja pääsee kaikkien kiteessä olevien proteiinimolekyylien pinnalla oleviin reaktiivisiin kohtiin.

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (lyhenne MAD) on röntgenkristallografiassa hyödynnettävä menetelmä, jonka avulla voidaan määrittää biologisten makromolekyylien, kuten proteiinien ja DNA:n, rakenteita faasiongelman ratkaisemiseksi. Rakennetta koskeviin vaatimuksiin kuuluvat atomit, jotka aiheuttavat merkittävää sirontaa röntgensäteistä; erityisesti rikki- tai metalli-ionit metalloproteiineissa. Koska seleeni voi korvata luonnollisen rikin, sitä käytetään yleisemmin. Tämän tekniikan käyttö helpottaa kiteentekijää huomattavasti MIR-menetelmän (Multiple Isomorphous Replacement) käyttämistä, koska raskaiden yhdisteiden valmistaminen on tarpeetonta.

Tätä menetelmää käytetään faasiongelmien ratkaisemiseen silloin, kun amplitudien lisäksi ei ole saatavilla tietoja sironneesta diffraktiosta. Lisäksi sitä käytetään, kun raskasmetalliatomi on jo sitoutunut proteiinin sisälle tai kun proteiinikiteet eivät ole isomorfisia, mikä ei sovellu MIR-menetelmään. Menetelmää on käytetty enimmäkseen raskasmetalliliuoksille, nämä metallientsyymit ovat yleensä peräisin 1. siirtymäsarjasta ja niiden naapureista. on tärkeää, että tämän kokeen suorittamiseksi on olemassa voimakkaan magneettikentän lähde, ja ympäristöä, kuten maanalaista, olisi harkittava. Menetelmään tarvitaan myös hiukkaskiihdytin, jota kutsutaan synkrotroniksi.

Yhden aallonpituuden anomaalinen diffraktiomenetelmä Muokkaa

Vertailtaessa usean aallonpituuden anomaaliseen diffraktioon (Multi-wavelength anomalous diffraction, MAD), yhden aallonpituuden anomaalisessa diffraktiossa (Single-wavelength anomalous diffraction, SAD) käytetään vain yhtä dataa yhdeltä aallonpituudelta. Tärkein hyödyllinen ero MAD:n ja SAD:n välillä on se, että kide viettää vähemmän aikaa röntgensäteessä SAD:ssä, mikä vähentää molekyylin mahdollisia säteilyvaurioita. Koska SAD käyttää vain yhtä aallonpituutta, se on myös ajallisesti tehokkaampi kuin MAD.

Yksittäisen aallonpituuden anomaalisesta diffraktiodatasta johdettuihin elektronitiheyskarttoihin on tehtävä muutoksia vaiheen epäselvyyksien ratkaisemiseksi. Yleinen modifiointitekniikka on liuottimen litistäminen, ja kun SAD yhdistetään liuottimen litistämiseen, syntyvät elektronitiheyskartat ovat laadultaan verrattavissa niihin, jotka on johdettu täydellisestä MAD-vaiheistuksesta. Liuottimen litistämisessä säädetään elektronitiheyttä proteiinimolekyylien väliin jäävillä alueilla, jotka liuotin on miehittänyt. Liuottimen alueen oletetaan olevan proteiiniin verrattuna suhteellisen epäjärjestynyt ja piirteetön. Liuotinalueiden elektronitiheyden tasoittaminen parantaa proteiinin elektronitiheyttä tulkittavissa olevassa määrin. Tätä menetelmää kutsutaan ISAS:ksi, iterative single-wavelength anomalous scattering.

Suorat menetelmätEdit

Suoralla menetelmällä voidaan palauttaa faasit saamansa datan avulla. Suora menetelmä arvioi alku- ja laajenevia vaiheita kolmoissuhteen avulla. Kolminkertainen (trio) relaatio on yhden heijastuksen intensiteetin ja vaiheen suhde kahteen muuhun intensiteettiin ja vaiheeseen. Tätä menetelmää käytettäessä proteiinirakenteen koolla on merkitystä, koska vaiheiden todennäköisyysjakauma on kääntäen verrannollinen atomien lukumäärän neliöjuureen. Suora menetelmä on käyttökelpoisin tekniikka vaiheongelmien ratkaisemiseen.