Ihmisillä noin 5-8 litraa ilmaa kulkee keuhkoista sisään ja ulos minuutissa levossa. Ilman happi- ja hiilidioksidipitoisuudet voivat vaihdella, se voi sisältää allergeeneja ja aiheuttaa eriasteista mekaanista venytystä hengitysteihin ja kaasunvaihtopintoihin. Nämä signaalit aistitaan, välitetään ja käsitellään fysiologisiksi tuotoksiksi, kuten keuhkojen verenpaineen, immuunivasteiden ja hengitysrytmin ohjaamiseksi, mutta mekanismi on epäselvä. Keuhkojen neuroendokriinisia soluja (PNEC) esiintyy monissa eri organismeissa kaloista nisäkkäisiin (1). Nisäkkäiden keuhkoissa PNEC-solut ovat ainoat hermotetut hengitysteiden epiteelisolut, ja niiden osuus keuhkojen epiteelisolujen kokonaispopulaatiosta on alle 1 % (2). Vaikka in vitro -näyttö on osoittanut PNEC-solujen osallistuvan hapen havaitsemiseen, keuhkoputkien ja verisuonten sileän lihaksen tonukseen ja immuunivasteisiin (1, 3), näitä tehtäviä ei ole osoitettu in vivo. Tuore tutkimus osoitti, että PNEC-solujen geneettinen ablaatio aikuisilla ei vaarantanut homeostaasiaa tai hengitysteiden korjautumista, joten näiden solujen merkitys in vivo on kyseenalainen (4). PNEC-patologioita, erityisesti PNEC:n määrän lisääntymistä, on todettu useissa keuhkosairauksissa, kuten astmassa, keuhkopulmonaalisessa dysplasiassa, kystisessä fibroosissa, kroonisessa obstruktiivisessa keuhkosairaudessa, synnynnäisessä palleatyrässä, imeväisiässä esiintyvässä neuroendokriinisessä hyperplasiassa, äkillisessä lapsikuoleman oireyhtymässä (äkillinen kuoleman oireyhtymä) ja keuhkoverenpainetaudissa (5-8). Kussakin tapauksessa on edelleen epäselvää, onko PNEC:n lisääntyminen oireiden syy vai seuraus.

Hiiren keuhkoissa useimmat PNEC:t sijaitsevat ~3-20 solun klustereissa, joita kutsutaan neuroepiteelielimiksi (NEB) (3, 9). Sekä yksinäiset että klusteroidut PNEC:t sisältävät tiheitä ydinvesikkeleitä, jotka ovat täynnä bioaktiivisia neuropeptidejä, kuten kalsitoniinigeeniin liittyvää peptidiä (calcitonin gene-related peptide, CGRP) tai amiineja, kuten serotoniinia (1). Näitä vapautuu vastauksena ärsykkeisiin, kuten happipitoisuuden muutoksiin. Neuropeptidien ja amiinien on todettu osallistuvan joihinkin samoihin prosesseihin kuin PNEC:t (10-12), mikä herättää mahdollisuuden, että ne voivat välittää PNEC:n toimintaa. Syy-yhteyttä ei kuitenkaan ole osoitettu in vivo.

Aloitimme tämän tutkimuksen paljastaaksemme mekanismit, jotka ovat synnynnäisen palleatyrän (CDH) taustalla, synnynnäinen epämuodostuma, johon liittyy huomattavia keuhkojen toimintahäiriöitä, mukaan lukien kohonnut immuunivaste ja keuhkohypertensio (13). CDH:n geneettisessä hiirimallissa havaitsimme epäonnistuneen PNEC-klusteroinnin vian. Tätä seuraa tapahtumien sarja: PNEC:n neuropeptidien lisääntyminen, immuuni-infiltraattien lisääntyminen ja keuhkojen rakenteen uudelleenmuodostus. Nämä havainnot tarjoavat in vivo -demonstraation PNEC:n toiminnasta. Koska PNEC:n lukumäärän ja siihen liittyvien neuropeptidien muutokset on dokumentoitu monissa keuhkosairauksissa, tuloksillamme on laajoja vaikutuksia CDH:ta laajemminkin.

Ihmisillä pyöreäkiertoisen reseptorin (ROBO) geenien mutaatiot on yhdistetty CDH:hon (13, 14). Tutkiaksemme CDH:hen liittyviä keuhkovaurioita inaktivoimme sekä Robo1:n että Robo2:n endodermistä peräisin olevassa epiteelissä, mukaan lukien keuhko, käyttämällä hiirissä Shhcre-geeniä (jäljempänä Shhcre;Robo-mutantti) (15, 16). Vaikka nämä mutantit selviytyvät hengissä, niillä on vähentynyt kaasunvaihtopinta-ala syntymän jälkeisestä päivästä (P) 15 alkaen (kuva 1, A ja B, ja kuva S1). Teimme mikrosirututkimuksen, jota seurasi kvantitatiivinen käänteinen transkriptaasipolymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) P7:ssä, ennen kaasunvaihtopinta-alan pienenemistä. Viisitoista 20:stä eniten differentiaalisesti ekspressoituneesta geenistä 15:n on todettu liittyvän immuunivasteisiin, ja kaikki ovat lisääntyneet merkittävästi, mukaan lukien Ccl3, Cxcl2, Tnfa ja Saa3 (kuva 1C). Tämän allekirjoituksen mukaisesti havaitsimme kohonneita immuunisolujen, kuten neutrofiilien, eosinofiilien, makrofagien ja T-solujen lukumääriä (kuva 1, D ja E, ja kuva S2). Lisäksi M2-makrofagien osuus kasvaa ja M1-makrofagien osuus vähenee (kuva S3). Nämä havainnot osoittavat, että Shhcre;Robo-mutantit osoittavat kohonnutta immuunisensitiivisyyttä, joka jäljittelee yleistä CDH:n liitännäissairautta (13).

Vaikka Robo ilmentyy keuhkojen mesenkyymin alveolaarisella alueella (kuva S4), sen ilmentyminen epiteelissä rajoittuu harvoihin soluihin hengitysteiden varrella (kuva 1F). Värimerkintä CGRP-vasta-aineella paljasti, että Roboa ilmentävät epiteelisolut ovat PNEC-soluja (kuva 1G). Vahvistaaksemme, että Robo-geenit ovat PNEC:ssä toiminnan kannalta välttämättömiä, inaktivoimme Robon käyttämällä Ascl1creERT2:ta (17), knock-in cre-ajuria, joka antaa PNEC-spesifisen aktiivisuuden keuhkoepiteelissä (kuva S5). Havaitsimme, että Ascl1creERT2;Robo-mutantit osoittivat sekä alveolaarista yksinkertaistumista että makrofagien lisääntymistä, mikä toisti Shhcre;Robo-fenotyypit (kuva S6). Nämä havainnot yhdessä osoittavat, että Roboa tarvitaan nimenomaan PNEC:ssä rajoittamaan immuunisolujen määrää ja estämään alveolaarinen yksinkertaistuminen.

Alkiopäivänä (E) 13,5 äskettäin spesifioituneet PNEC:t olivat yksinäisiä soluja sekä kontrolli- että Shhcre;Robo-mutaation keuhkoissa (Kuva 2, A ja B). E15,5:een mennessä suurin osa PNEC-soluista oli aggregoitunut NEB-soluiksi kontrollissa. PNEC-solut eivät kuitenkaan olleet klusteroituneet Shhcre;Robo-mutaatioissa (Kuva 2, C ja D). Tämä erittäin läpäisevä fenotyyppi säilyi postnataalisissa keuhkoissa (kuva 2, E ja F ja kuva S7). PNEC-solujen kokonaislukumäärään ei näytä vaikuttavan, mitä tukee Ascl1:n ja muiden PNEC-markkereiden normaali ilmentyminen (kuva S8). Mutantin klusteroimattomat solut menettävät kiilamaisen muotonsa ja ovat pyöreämpiä (kuvat S7 ja S9). Lisäksi toisin kuin kontrolleissa, joissa yksinäiset PNEC-solut eivät ole innervoituneita (9), ~33,3 % (31 solua 93:sta) klusteroimattomista PNEC-soluista on innervoituneita mutantissa (kuva 2F ja kuva. S9), mikä viittaa siihen, että PNEC:n innervoituminen ei ole riippuvainen klusterin muodostumisesta tai Robon toiminnasta PNEC:ssä.

Ascl1creERT2;Robo -mutaatioissa esiintyy myös PNEC:n klusteroitumista (kuva S10). Tämä fenotyyppi ilmeni myös silloin, kun Robo-inaktivaatio indusoitiin postnataalisesti, mikä tapahtuu NEB:n muodostumisen jälkeen. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että Roboa tarvitaan PNEC:n kokoonpanoon ja ylläpitoon NEB:ssä.

Robo voi toimia joko riippuvaisena tai riippumattomana sen ligandista, Slitistä (18). Slit-mutanttien analyysi osoittaa, että vaikka PNEC-klusteroituminen ei vaikuta yhdessäkään yksittäisessä mutantissa, se vähenee Slit1;3-mutanteissa (kuva S11, A-D). Tämä tulos viittaa siihen, että Robon toiminta tässä prosessissa on todennäköisesti ligandiriippuvaista.

Slit ja Robo toimivat ensisijaisesti välittäen solujen repulsiota ja harvoin vetovoimaa (19). Määrittääksemme, toimiiko Slit repulsiivisena vai vetovoimaisena signaalina Roboa ilmentäville PNEC:ille, määrittelimme ensin, missä Slit-geenit ilmentyvät. Yhdistetty Slit1;2-GFP (vihreä fluoresoiva proteiini) -reportteri paljasti ilmentymisen vain noin 1-3 PNEC:ssä suurten NEB:ien sisällä, mikä herättää mahdollisuuden, että Slit1/2:ta ilmentävät solut voivat olla klusterin ydinsoluja (kuva S11E). Tämä viittaa myös PNEC:n subspesialisoitumiseen klusterin sisällä. Slit3:n ilmentyminen rajoittuu valtimoita ympäröivään verisuonten sileälihassolukerrokseen, joka kulkee pääkeuhkoputkien varrella, jossa sijaitsee suurin osa NEB:istä (kuva S11, F ja G). Yhdessä Slit-ekspressoivien solujen läheisyys Robo-ekspressoiviin PNEC-soluihin herätti mahdollisuuden, että Slit-ligandit voivat tarjota houkuttelevan vihjeen PNEC-soluille.

Testaamiseksi tämä testattiin virtaussytometrialla lajiteltuja GAD1-GFP+ PNEC-soluja istutettiin Boydenin solujen migraatioviljelysinsertin yläkammioon. Kun Slit-proteiinia lisättiin solujen kanssa yläkammioon, ~52 % vähemmän (P = 8,5 × 10-4) PNEC-soluja vaelsi pohjaan (kuva S12, J-I). Sitä vastoin kun Slit-proteiinia lisättiin pohjakammioon, 18 % enemmän (P = 7,5 × 10-5) PNEC-soluja siirtyi pohjaan (kuva S11, L-N). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Slit-Robo ajaa PNEC:n klusteroitumista NEB:iin todennäköisesti soluvetovoiman kautta.

Testaamaan mahdollista yhteyttä PNEC:ien ja immuunivasteen välillä testasimme PNEC:ien tuottamien neuropeptidien ilmentymistä (1). Yhdeksästä testatusta neuropeptidigeenistä viisi oli merkittävästi säännelty ylöspäin Shhcre;Robo-mutaatioissa (Kuva 3A). Värjäys CGRP:tä vastaan tarkoitetulla vasta-aineella osoitti, että vaikka sen ilmentyminen säilyy mutantin PNEC-soluissa, värjäytymisen voimakkuus on lisääntynyt eikä se enää rajoitu näiden solujen basaalipuolelle (kuvat S7 ja S9). Huomaamme myös, että vaikka ryhmittymättömyys tapahtui E15,5:een mennessä, neuropeptidien nouseva säätely havaitaan vasta syntymän jälkeen, oletettavasti altistuttaessa ilmalle (kuva S12).

Määrittääksemme, myötävaikuttaako neuropeptidien lisääntyminen immuunivasteeseen, keskityimme CGRP:hen, koska sen transkripti osoittaa suurinta lisääntymistä kaikista testatuista (kuva 3A). Vastasimme tätä kasvua kasvattamalla Cgrp:n mutanttialleelin Shhcre;Robo-taustaan (20). Robo-kontrollissa Cgrp:n menetys ei muuttanut makrofagien määrää (Kuva 3, B, D ja F). Shhcre;Robo-mutaatioissa Cgrp:n menetys kuitenkin vähensi makrofagien lukumäärää merkittävästi annosriippuvaisesti (Kuva 3, C, E ja F). Havaitsimme myös, että Cgrp:n menetys kumosi osittain alveolien yksinkertaistumisfenotyypin (kuva S13). Huomaamme, että makrofagien lisääntymistä tai alveolaarista yksinkertaistumista ei estetty kokonaan, mikä viittaa siihen, että muiden neuropeptidien lisääntyminen voi lisätä myöhempiä tuloksia. Yhdessä nämä tulokset tarjoavat in vivo -geneettisen osoituksen siitä, että neuropeptidit välittävät PNEC:n toimintaa.

Koska normaali alveologeneesi alkaa P4:ssä (21), alveolaarisen yksinkertaistumisen myöhäinen ilmaantuminen P15:ssä viittaa siihen, että alveologeneesin häiriö ei välttämättä ole ensisijainen syy. Vaikka solukuolemassa ei havaittu muutosta P10:een mennessä, elastiinin määrä väheni selvästi (kuva S14), mikä on mahdollinen yksinkertaistumisen laukaiseva tekijä (22). Immuunisolut, kuten makrofagit, ilmentävät matriksin metalloproteinaaseja, jotka hajottavat elastiinia (23). Lisäksi makrofagien lisääntyminen havaitaan ennen yksinkertaistumista (kuvat S1 ja S2), mikä lisää syy-yhteyden mahdollisuutta. Tämän testaamiseksi käsittelimme Shhcre;Robo- ja kontrollikeuhkoja klodronaatilla, hydrofiilisellä lääkkeellä, joka tyhjentää makrofageja (24). Hoito, joka aloitettiin P5:ssä, ennen immuunisolujen lisääntymistä, rajoitti tehokkaasti alveolimakrofagien määrän lähtötasolle Shhcre;Robo-mutaatioissa (Kuva 4, A-E). Tämä vaimensi elastiinin vähenemistä ja esti yksinkertaistumisen kokonaan (Kuva 4, F-J, ja kuva S15). Yhdessä nämä tiedot tarjoavat in vivo -demonstraation siitä, että lisääntyneet immuuni-infiltraatit ovat vastuussa alveolien yksinkertaistumisesta ja että molemmat ovat PNEC:n toimintahäiriön myöhempiä seurauksia.

Tässä tutkimuksessa esitämme in vivo -geneettistä näyttöä, joka osoittaa, että PNEC:llä on harvinaisuudestaan huolimatta syvällinen vaikutus postnataaliseen keuhkojen toimintaan. Vaikka PNEC-vika on ilmeinen jo E15.5:ssä Shhcre;Robo -mutantissa, fysiologiset seuraukset, jotka alkavat neuropeptidien ylössäätelystä, alkavat syntymän jälkeen. Tämä viittaa siihen, että PNEC:n vaikutus on riippuvainen keuhkojen altistumisesta ilmalle. Näin ollen löydöksemme rajaavat signaalinsiirtotavan, jossa PNEC:t ovat herkkiä reostaatteja hengitysteiden seinämässä, jotka kääntävät ympäristön vihjeet ei-soluautonomisesti immuunivasteiksi.

Tuloksemme osoittavat Robo1,2:n olevan joukko geenejä, jotka kontrolloivat PNEC:ien klusteroitumista NEB:iin. Se esittelee myös Slitin ja Robon toimijoina selektiivisessä solujen lajittelussa nisäkkään elimen epiteelissä. Robon inaktivointi NEB:n muodostumisen jälkeen johti myös klusteroitumisen purkamiseen, mikä viittaa siihen, että klustereita ylläpidetään aktiivisesti. Vaikka Slit-Robon tiedetään suurelta osin välittävän solujen hylkimistä, tietomme osoittavat, että ne ohjaavat PNEC-klusterien muodostumista solujen vetovoiman avulla. Robo-inaktivaatio johti muuttuneeseen innervaatioon ja neuropeptidien basaalisen vinoutuneen lokalisoinnin menetykseen. Nämä muutokset voivat olla PNEC:ien muuttuneen downstream-vaikutuksen taustalla.

PNEC:ien määrän lisääntyminen on dokumentoitu monissa keuhkoihin liittyvissä sairauksissa, jotka vaihtelevat harvinaisista sairauksista, kuten CDH:sta, yleisiin sairauksiin, kuten astmaan (5-8). Huomaamme, että Robo-mutantin PNEC-fenotyyppi eroaa PNEC:n lisääntyneestä lukumäärästä. Molempiin liittyy kuitenkin lisääntyneitä neuropeptidejä, joiden osoitamme olevan voimakkaita PNEC-toiminnan vaikuttajia. Löydöksemme ennustavat siten, että sen sijaan, että dokumentoidut PNEC-patologiat ja neuropeptidien lisääntyminen olisivat taudin passiivisia lukemia, ne voivat toimia aktiivisina oireiden aiheuttajina monissa hengityselinsairauksissa.