FOTOTOKSISUUDEN TESTIMENETELMÄT JA ELÄINVAIHTOEHTOEHTOISET TESTIMENETELMÄT

Kemikaalien valoturvallisuuden varmistaminen on olennaista silloin, kun ihmisten altistuminen voi olla mahdollista, kuten lääkkeet (20) tai kosmetiikka (21) selvästi osoittavat. Kemikaalin mahdollisen fototoksisuuden arvioimiseksi on otettu käyttöön erilaisia testimenetelmiä, jotka vaihtelevat in silico(22), in chemico(23), in vitro ja in vivo -testeistä. In chemico -testejä, kuten ROS:n tuottaminen (24), in vitro -testejä, joihin kuuluvat 3T3 NRU -testi ja 3D-epidermismalli, sekä in vivo -tutkimuksia, joissa käytetään marsua, hiirtä tai pigmentoituneita rottia, on kehitetty ja niitä käytetään rutiininomaisesti (25).

Valonlähde valomyrkyllisyydelle. Valonlähde valomyrkyllisyyttä varten on erittäin tärkeä, koska testikemikaalin absorboimien aallonpituuksien (absorptiospektri) ja valon annoksen (saavutettavissa kohtuullisessa altistusajassa) on oltava riittävät valomyrkyllisyyden aikaansaamiseksi (26). Luonnollista auringonvaloa simuloivia aurinkosimulaattoreita pidetään ihanteellisena keinotekoisena valonlähteenä (kuva 5).

Suodatetun aurinkosimulaattorin säteilytehojakauman tulisi olla lähellä ulkoilman päivänvaloa. Aurinkosimulaattorit on varustettu ksenonkaarilla tai (seostetuilla) elohopea-metallihalogenidikaarilla. Ne olisi myös suodatettava sopivalla tavalla, jotta erittäin sytotoksisia UVB-aallonpituuksia voidaan vaimentaa. Näiden suodattimien alapuolella rekisteröidyn spektrin ei pitäisi poiketa standardoidusta päivänvalosta (Specification: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Muita UVA-valonlähteitä, kuten UVA-lamppua, voidaan kuitenkin käyttää myös asianmukaisen UV-dosimetrin kanssa intensiteetin ja aallonpituuden tarkistamiseksi. Valon voimakkuus (irradianssi) vaihtelee lähteistä riippuen, ja se olisi tarkistettava säännöllisesti ennen jokaista valomyrkyllisyystestiä sopivalla laajakaistaisella UV-mittarilla. UV-mittari on kalibroitava ennen jokaista mittausta. Vastaavasti säteilytysaika riippuu valonlähteen intensiteetistä (esim. 1,7 mW/cm2 -valonlähteellä tarvitaan 50 minuuttia valotusaikaa, jotta saavutetaan 5 J/cm2). Säteilytysaika vaihtelee myös testimenetelmien mukaan. Annos 5 J/cm2 (UVA-alueella mitattuna) todettiin ei-sytotoksiseksi, mutta riittävän voimakkaaksi herättämään kemikaaleja aiheuttamaan fototoksisia reaktioita 3T3:n neutraalipunaisen punaisen imeytymismäärityksessä.

3T3 Neutraalipunan imeytymismääritys. OECD on virallisesti hyväksynyt 3T3 NRU-määrityksen, ja se on hyväksytty OECD TG432 -nimellä 13. huhtikuuta 2004 (3). Tällä testillä arvioidaan valosytotoksisuutta määrittämällä solujen elinkelpoisuuden suhteellinen väheneminen sen jälkeen, kun ne on altistettu testattavalle tuotteelle UV/VIS-säteilyn läsnä ollessa tai ilman sitä. Päätös 3T3 NRU -valomyrkyllisyystestin suorittamisesta tehdään kemikaaleille, joilla on absorptiospektri UV/VIS-alueella, kun ne liuotetaan sopivaan liuottimeen (17). On ehdotettu, että jos molaarinen ekstinktio-/absorptiokerroin on alle 10 litraa x mol-1 x cm-1, kemikaali ei todennäköisesti ole fotoreaktiivinen (esim. UV-kyvetissä, jossa on 1 cm:n pituinen valopolku, 0,05 M:n liuoksen OD:n on oltava alle 0,5, jotta sitä voidaan pitää ei-fotoreaktiivisena yhtälön ”absorbanssi = ekstinktiokerroin x valopolun pituus x konsentraatio” perusteella) perusteella (26). 3T3 NRU -testillä on erittäin herkkä mutta alhainen spesifinen ennustuskyky (herkkyys 93 % ja spesifisyys 84 %). 3T3 NRU -testillä on monia rajoituksia. Sillä ei voida ennustaa muita haittavaikutuksia kuin valo-(syto)toksisuutta, joka voi aiheutua kemikaalin ja valon yhteisvaikutuksesta, kuten fotogenotoksisuutta, fotoallergiaa (fotosensibilisaatiota) tai fotokarsinogeenisuutta. 3T3 NRU -testiä käytetään ainoastaan vaarojen tunnistamiseen, kun taas sen käyttökelpoisuus valomyrkyllisen tehon arvioinnissa ei ole perusteltua. 3T3 NRU -testistä puuttuu erityisesti metabolinen aktiivisuus, joka on kriittinen tekijä systeemisesti altistuvien kemikaalien ilmenemisessä. Sen vuoksi suositellaan in vivo -eläintutkimuksia, kun on kyse systeemisesti altistuvista kemikaaleista, jotka edellyttävät metabolista aktivoitumista, kuten monokrotaliini, riddelliini ja heliotriini (pyrrolizidiinialkaloidit) (28) (5,29).

3T3 NRU:n perustavanlaatuinen testausperiaate on solujen elinkykyisyyden vertailu UV/Vis-säteilyn läsnä ollessa tai ilman UV/Vis-säteilytystä määritettynä elintärkeällä väriaineella, neutraalipunaisella, joka on heikko kationinen väriaine, joka tunkeutuu helposti solukalvojen läpi ja kerääntyy solunsisäisesti elinkykyisten solujen lysosomeihin. Perussolulinja on Balb/c 3T3-solu, joka on hiiren fibroblasti, jonka G.T. Todaro kehitti hiiren alkioista vuonna 1968. Nimitys 3T3 tarkoittaa ”3 päivän siirto, inokulaatio 3 × 105 solua” 20 cm2 :n lautaselle, ja tämä solu on suhteellisen vakaa, helposti saatavilla ja helppo käsitellä (30). Ihon fibroblastit ovat yksi valomyrkyllisyyden kohdesoluista, mikä antaa vankan perusteen 3T3-solujen käytölle.

Mutta jotta voidaan päättää, onko testattava tuote valomyrkyllinen vai ei 3T3 NRU-määrityksessä, pitoisuusvaste on saatava säteilyn läsnä ollessa ja ilman säteilyä. Valoärsytyskerroin (PIF) tai keskimääräinen valovaikutus (MPE) on laskettava (31). PIF on IC50:n (pitoisuus, joka vähentää solujen elinkelpoisuutta 50 %) suhde säteilyttämättömän ja säteilytetyn välillä, kuten kuvassa 7 on esitetty.

Fotosytotoksisuuden ennustemalli PIF:n (Photo-irritation factor) avulla.

Jos IC50:tä ei voida saada, MPE lasketaan seuraavalla yhtälöllä

PIF < 2 tai MPE < 0,1 ennustaa: ”ei valomyrkyllisyyttä”. PIF > 2 ja < 5 tai MPE > 0,1 ja < 0,15 ennustaa: ”todennäköinen fototoksisuus” ja PIF > 5 tai MPE > 0,15 ennustaa: ”valomyrkyllisyys” (kuva 8).

Fotovaikutuksen laskenta: Valovaikutus (PEC) mielivaltaisella pitoisuudella C määritellään vastevaikutuksen (REC) ja annosvaikutuksen (DEC) tulona, eli PEC = REC × DEC. Määritelmä on esitetty taulukossa (31). Valovaikutuksen laskeminen konsentraatiolla 0,4 tekstissä esitettyjen yhtälöiden mukaisesti antaa seuraavat tulokset: vastevaikutus RE0,4 = (66 % – 11 %)/100 % = 0,55, annosvaikutus DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43 ja valovaikutus PE0,4 = 0,24. Keskimääräinen valovaikutus saadaan laskemalla valovaikutuksen arvojen keskiarvo eri pitoisuuksilla (31).

Erythrosyyttien hemolyysi testi. Solukalvot ovat alttiita valokemiallisesti tuotetuille ROS:ille ja radikaaleille. UVA:n aiheuttamia erytrosyyttien vaurioita ja niistä johtuvaa hemolyysiä (fotohemolyysi) käytetään hyväksi testattavien tuotteiden fototoksisen potentiaalin arvioimiseksi (32). Lampaiden punasoluja (SRBC) inkuboidaan kemikaalien kanssa ja säteilytetään UVA:lla 20 J/cm2. Säteilytyksen jälkeen SRBC-soluja inkuboitiin pimeässä 2 tuntia huoneenlämmössä ja sitten vielä 1 tunti 37 ℃:ssa, minkä jälkeen hemolyysi mitattiin Drabkinin reagenssilla ja UV-absorbanssin mittauksella 540 nm:ssä. Fototoksisuuden laajuus arvioitiin hemoglobiinin vapautumisella SRBC:stä eli fotohemolyyttisellä aktiivisuudella yhtälön (33) mukaisesti.

• ADE: altistetun lääkeliuoksen optinen tiheys erytrosyyttien kanssa

• AD: altistetun lääkeliuoksen optinen tiheys ilman erytrosyyttejä

• C: optinen tiheys 100-prosenttisesti hemolyyttisen kontrolliliuoksen optinen tiheys

Potoksiset aineet, kuten siprofloksasiini, norfloksasiini tai enoksasiini, lisäävät fotohemolyyttistä aktiivisuutta merkittävästi yli 20 %:lla 100 μg/ml:ssa. Tämän testin herkkyys oli 67 %, spesifisyys 73 % ja tarkkuus 73 % 24 kemikaalin osalta (8 hajustetta, 5 UV-absorberia, 4 lääkettä, 4 mikrobilääkettä ja 3 väriainetta) verrattuna in vivo -koe-eläinkokeeseen (34). Alhainen herkkyys voi olla ongelmallinen, ja sen suorituskyky on paljon huonompi kuin 3T3 NRU -testin, mikä voi selittää tämän testin käytön vähenemisen viime aikoina.

In vitro ihmisen 3D-epidermismalli. Solupohjaisten in vitro -menetelmien rajoitusten poistamiseksi tutkitaan parhaillaan 3D-rekonstruoidun epidermiksen mallin soveltamista valomyrkyllisyystesteihin (35,36). Testin periaate on periaatteessa samanlainen kuin 3T3 NRU -testissä, nimittäin kudoksen elinkelpoisuuden eron arviointi UV/VIS-säteilyn läsnä ollessa ja ilman sitä. Samanlaista ennustemallia, jossa käytetään PIF- ja MPE-arvoja, voidaan käyttää (37). 3D-epidermismallissa voidaan kuitenkin testata veteen liukenemattomia aineita, ja epidermiskerroksen primäärisissä keratinosyyteissä säilyy tietyssä määrin aineenvaihduntakapasiteettia, jota voidaan soveltaa metabolista aktivaatiota vaativiin toksisiin aineisiin (38). Lisäksi sytokiinituotannon, kuten IL-1β:n (interleukiini-1β) (39), mittaaminen, komeettatesti (40) ja histologinen tutkimus ovat mahdollisia, ja ne voidaan ottaa huomioon arvioitaessa edelleen fotoallergeenisuutta ja fotokarsinogeenisuutta.

In vivo -menetelmät, joissa käytetään marsua, hiirtä tai pigmentoituja rottia. Laboratorioeläimiä, kuten hiiriä ja marsuja, käytetään simuloimaan todellista skenaariota ihmisen valomyrkyllisyydestä. Eläimet altistetaan kemikaaleille paikallisesti tai systeemisesti ja ne säteilytetään sopivalla UVA-annoksella (yleensä 10 J/cm2 marsukokeessa ja 20 J/cm2 hiirikokeessa (41)). Eryteeman ja turvotuksen pistemäärät 0:sta 4:ään lasketaan yhteen ja suurin pistemäärä 72 tunnin tarkkailun aikana lasketaan keskiarvona eläintä kohti, jolloin saadaan ärsytysindeksi. Fototoksisuusindeksi saadaan yhtälöllä ”UVA-säteilytetyn kohdan ärsytysindeksi – säteilyttämättömän kohdan ärsytysindeksi” (42). Yli 0,6 valomyrkyllisyysindeksi osoittaa mahdollisen valomyrkyllisyyden. Vaihtoehtoisesti korvan paksuus voidaan mitata turvotuksen arvioimiseksi hiirikokeissa. Nämä in vivo -testit kuvastavat hyvin valomyrkyllisyyden patofysiologista prosessia ihmisessä, mutta eläinten uhraaminen, kustannukset ja testin suorittamiseen tarvittava aika aiheuttavat monia ongelmia erityisesti aikana, jolloin eläinten hyvinvoinnista ja etiikasta ollaan yleisesti tietoisia. Muihin kuin eläimiin perustuvat valomyrkyllisyystestit ovat nykyään yhä suositumpia näiden ongelmien ratkaisemiseksi (43).

In chemico methods for phototoxicity evaluation. Soluttomia koeputkimenetelmiä eli in chemico -menetelmiä on tutkittu valomyrkyllisyyden arvioimiseksi. Tietoja testattavan tuotteen valon absorptiosta ja fotostabiilisuudesta on analysoitu fototoksisuuden ennustamiseksi (44). Kemikaalin fototoksinen potentiaali voidaan arvioida in chemico -menetelmällä, jossa käytetään reaktiivisten happilajien muodostumista valoherkistyksen ja sitä seuraavan fotoreaktion aikana (12). Singlettihappi havaitaan p-nitrosodimetyylianiliinin (RNO) valkaisulla, kun taas nitrosoblue-tetratsolium-testiä (NBT-formazaanireaktio) käytetään peroksidin muodostumisen määrittämiseen alla olevan kuvan mukaisesti (24),

• Singlet-happi + imidatsoli

• → → hapettunut imidatsoli

• + RNO

• → RNO:n valkaisu + tuotteet

ROS:n synnyn määrityksen herkkyys ja spesifisyys olivat 90 % ja 76.9 % kosmeettisten aineiden osalta ja 100 % ja 75 % muiden kuin kosmeettisten kemikaalien osalta. DNA-juosteen katkaisuaktiivisuus on toinen tapa arvioida erilaisten kemikaalien tai lääkkeiden UV-indusoitua fototoksisuutta kemikossa määrittelemällä avoimen tai suljetun pyöreän DNA:n määrää. Tämä määritys ei myöskään edellytä eläviä soluja tai kudoksia, vaan plasmidia. Plasmidi liuotetaan puskuriin ja sekoitetaan testiaineisiin. Kun seos on säteilytetty UV-säteilyllä, näytteet altistetaan elektroforeesille. Rikkoutuneen DNA:n määrä analysoidaan fluoresenssiin perustuvalla tekniikalla. UV:n indusoima fototoksinen yhdiste johtaa DNA-säikeiden avautumiseen, ja se on riippuvainen lääkeaineen pitoisuudesta ja UV-säteilytysannoksesta (33). Näissä testeissä ei tarvita eläviä soluja tai kudoksia, jotka voivat lisätä testitulosten vaihtelua. Näihin menetelmiin liittyy kuitenkin rajoituksia, joita ovat metabolisen aktivointikapasiteetin puute, soveltumattomuus veteen liukenemattomiin materiaaleihin (öljyt, kiinteät aineet, geelit, formuloidut tuotteet) ja kyvyttömyys ennustaa fotogenotoksisuutta, fotoallergiaa (fotosensibilisaatiota) tai fotokarsinogeenisuutta. Tämä testi on rajoitettu vaarojen tunnistamiseen, ei valomyrkyllisen tehon arviointiin.