PMC
Käyttämällä NEBcutteria
NEBcutter hyväksyy syötesekvenssin, joka voidaan liittää sisään, poimia paikallisesta tiedostosta tai hakea NCBI:stä GenBank-tiedostona sen liittymisnumeron avulla. Käytettävissä on useita vaihtoehtoja, joilla voidaan valita näytettävien ORF:ien koko ja käytettävien restriktioentsyymien joukko. Ohjelma laskee kaikkien restriktioentsyymikohtien sijainnit ja huomioi ne, joita päällekkäinen metylaatio saattaa estää, ja etsii ORF:t sekvenssistä. Sen jälkeen se näyttää kaaviokuvan sekvenssistä, pitkät ORF:t menetelmissä kuvattujen sääntöjen perusteella ja kaikki restriktioentsyymit, jotka leikkaavat sen vain kerran. Aloitusnäytössä näytetään myös entsyymit, joita voidaan käyttää täydellisessä digestoinnissa kunkin näytetyn ORF:n leikkaamiseen. Kuvassa Kuva11 esitetään tyypillinen digesti, tässä tapauksessa lineaarinen näkymä plasmidista pBR322. Jos alkuperäinen DNA-sekvenssi on sirkulaarinen, tarjolla on sekä lineaarinen että sirkulaarinen näyttö. Alkuperäisestä näytöstä voi edetä monin eri tavoin, mukaan lukien mukautettu digestio valitsemillasi entsyymeillä ja erilaiset digestin näytöt. Lineaarisista näytöistä on myös mahdollista zoomata valittua sekvenssin aluetta yksityiskohtaisemman näkymän saamiseksi. Yhden vaihtoehdon avulla voidaan valita tietty alue ja näyttää ne entsyymit, jotka leikkaavat alueen välittömässä läheisyydessä. Tämä on hyödyllistä, kun etsitään entsyymejä, jotka pystyvät leikkaamaan halutun alueen. Jos zoomaus johtaa <60 nukleotidin pituiseen alueeseen, varsinainen sekvenssi näytetään (Kuva (Kuva 2),2) yhdessä mahdollisen käännöksen kanssa. Tässä näytössä näkyvät kaikki entsyymit, jotka leikkaavat sekvenssin, kaikki emäkset, jotka muodostavat restriktioentsyymin tunnistussekvenssin osia, on korostettu, ja siirtämällä hiiren entsyymin nimen päälle saadaan aikaan laatikko, johon on merkitty tunnistussekvenssi, ja itse sekvenssi muuttuu näytössä alleviivatuksi.
Lineaarinen näyttö plasmidin pBR322 digestistä. Huomaa, että kahta tärkeintä ORF:ää reunustavat sivustot (MseI ja PflMI; BspHI ja EarI), joita voitaisiin käyttää niiden irrottamiseen koko plasmidisekvenssistä. Tässä näytössä esitetään vain entsyymit, jotka pilkkovat sekvenssin kerran. Vaihtoehdot lisäsulatukseen ja -näyttöön ovat käytettävissä näytön alareunassa olevien painikkeiden avulla.
Lyhyen alueen zoomattu näyttö pBR322:sta. Huomaa, että punaisella ja sinisellä korostetut emäkset muodostavat restriktioentsyymien tunnistuskohtien osia. Punaiset ovat yksiselitteisiä, kun taas siniset ovat degeneroituneita emäksiä. BsiEI tunnistaa siis sekvenssin CGRYCG. Ulommat CG-jäämät ovat muuttumattomia, kun taas sisemmät emäkset ovat degeneroituneita, ja näkyvässä sekvenssissä ne ovat GT. Mustalla esitetyt emäkset eivät kuulu mihinkään restriktioentsyymin tunnistuskohtaan. Tämä näyttö voi olla hyödyllinen, kun etsitään restriktioentsyymejä, jotka pystyvät erottamaan SNP-alleelit.
Missä tahansa päänäytössä, kun siirrät hiiren restriktioentsyymin nimen päälle, näytetään sen tunnistussekvenssi ja tarkka emäsnumero, jonka kohdalla se pilkkoo. Jos entsyymillä on useampi kuin yksi kohta, kaikki muut kohdat on alleviivattu. Napsauttamalla entsyymin nimeä avautuu sivu, jossa on yhteenveto entsyymiä koskevista tiedoista, mukaan lukien sen metylaatioherkkyys, tuotetut päätepisteet, saatavilla olevat isoskitsomeerit ja luettelo muista entsyymeistä, jotka voivat tuottaa yhteensopivia päätepisteitä. NEB:n entsyymien osalta annetaan tietoa sulatusolosuhteista ja linkki NEB:n verkkosivulle.
NEBcutterin keskeinen ominaisuus on se, että se sisältää kaiken sen, mitä REBASE-tietokantaan on tallennettu minkä tahansa näytettävän entsyymin metylaatio-herkkyydestä, kun ne ovat päällekkäin Dam-kohdan (GATC), Dcm-kohdan (CCWGG), CpG-kohdan, EcoKI-kohdan (AACN6GTGC) tai EcoBI-kohdan (TGAN8TGCT) kanssa. Kun teoreettiset digestit tehdään, tuloksiin sisältyy metylaation vaikutusten vertailu, jossa korostetaan siirtyvät kaistat (Kuva (Kuva 33).
Teoreettinen digesti, joka osoittaa päällekkäisen Dcm-metylaation vaikutukset sekvenssissä oleviin MscI-kohtiin (tunnistussekvenssi: TGGCCA), jos bakteriofaagilambda olisi kasvatettu Dcm-metyylitransferaasia (tunnistussekvenssi: CCWGG) ekspressoivassa E.coli-kannassa. Fragmentit, joihin Dcm-metylaatio vaikuttaa, on merkitty punaisella. Virtuaaligeeli perustuu tunnetun kokoisilla fragmenteilla tuotetuista kokeellisista tiedoista muodostetun kuutiollisen spline-käyrän interpolointiin.
Kullakin sivulla on pikalinkkejä, jotka johtavat takaisin pääsivulle, antavat apua näytön tulkintaan tai mahdollistavat kommenttien lähettämisen takaisin kirjoittajille. Käyttöliittymä on suunniteltu mahdollisimman intuitiiviseksi, ja se tarjoaa helpon pääsyn tärkeimpiin toimintoihin, jotka ovat hyödyllisiä DNA:ta pilkkoville tutkijoille. NEBcutterin nykyinen versio on käsitellyt yli 400 000 sekvenssiä käyttäjiltä. Valmistelemme parhaillaan useita parannuksia NEBcutteriin, ja versio 2.0 on tarkoitus julkaista 1. heinäkuuta mennessä.