Molekyylibiologian keskeinen dogmi on DNA→RNA→Proteiini. Tietyn proteiinin syntetisoimiseksi DNA on ensin transkriboitava sanansaattaja-RNA:ksi (mRNA). mRNA voidaan sitten kääntää ribosomissa polypeptidiketjuiksi, jotka muodostavat proteiinien primaarirakenteen. Useimpia proteiineja muokataan sen jälkeen erilaisilla posttranslationaalisilla modifikaatioilla, kuten proteiinien taittumisella, disulfidisiltojen muodostamisella, glykosylaatiolla ja asetylaatiolla, jotta saadaan aikaan toimivia ja vakaita proteiineja. Proteiinien ilmentymisellä tarkoitetaan tämän prosessin toista vaihetta: proteiinien synteesiä mRNA:sta ja posttranslationaalisten modifikaatioiden lisäämistä

Opi lisää molekyylibiologiasta Plasmidit 101 eBookissa!

Tutkijat käyttävät erilaisia tekniikoita kontrolloidakseen proteiinien ilmentymistä kokeellisissa, bioteknologisissa ja lääketieteellisissä sovelluksissa. Tutkijat voivat visualisoida proteiineja in vivo merkitsemällä ne fluoresoivilla proteiineilla paikannuksen tutkimiseksi tai puhdistaa proteiineja niiden rakenteen, vuorovaikutusten ja toimintojen tutkimiseksi. Proteiineja voidaan myös puhdistaa käytettäväksi molekyylibiologisessa tutkimuksessa (esim. polymeraaseja ja muita entsyymejä voidaan puhdistaa ja käyttää DNA:n manipulointiin) tai lääketieteessä (esim. insuliini).

Proteiineja, toisin kuin DNA:ta, joka voidaan suhteellisen helposti syntetisoida, on tuotettava soluista peräisin olevista monimutkaisista seoksista tai käyttämällä eläviä soluja. Proteiinien tuottamiseen ja puhdistamiseen käytetään useita erilaisia ekspressiojärjestelmiä. Näitä ovat nisäkäs-, hyönteis-, bakteeri-, kasvi-, hiiva- ja soluvapaat ekspressiojärjestelmät.

Yleinen proteiinien ekspressiostrategia koostuu solujen transfektoinnista valitsemallasi DNA-templaatilla ja siitä, että solujen annetaan transkriboitua, translitteroitua ja modifioida haluamaasi proteiinia. Modifioidut proteiinit voidaan sitten uuttaa lysoiduista soluista proteiinimerkkien avulla ja erottaa epäpuhtauksista erilaisilla puhdistusmenetelmillä. Se, mitä ekspressiojärjestelmää käytetään, riippuu useista tekijöistä:

1. Proteiini, jota yrität ilmentää
2. Paljonko proteiinia tarvitset
3. Suunnitelmasi jatkojalostussovelluksia varten

Tässä blogikirjoituksessa teemme yhteenvedon joistakin yleisimmistä ilmentämisjärjestelmistä, mukaan lukien niiden eduista ja varoittavista seikoista, jotka on syytä pitää mielessä, ennen kuin valitset järjestelmän.

Nisäkkäiden ekspressiojärjestelmät

Nisäkässolut ovat ihanteellinen järjestelmä sellaisten nisäkäsproteiinien ekspressioon, jotka vaativat useita translaation jälkeisiä modifikaatioita proteiinien asianmukaiseen toimintaan. Useimmat nisäkkäiden ekspressiota varten suunnitellut DNA-konstruktiot käyttävät viruspromoottoreita (SV40, CMV ja RSV) transfektion jälkeisen vahvan ekspression varmistamiseksi. Nisäkäsjärjestelmät voivat ilmentää proteiineja sekä ohimenevästi että vakaiden solulinjojen kautta. Molemmat menetelmät tuottavat runsaasti proteiineja, jos transfektio onnistuu.

Joidenkin nisäkäsjärjestelmien avulla voidaan myös kontrolloida sitä, milloin proteiini ilmentyy, käyttämällä konstitutiivisia ja indusoituvia promoottoreita. Indusoituvat promoottorit ovat erittäin hyödyllisiä, jos haluttu proteiinituote on myrkyllinen soluille suurina pitoisuuksina. Etuistaan huolimatta nisäkkäiden ekspressiojärjestelmät vaativat muihin järjestelmiin verrattuna vaativia soluviljelyolosuhteita.

Hyönteisten ekspressiojärjestelmät

Hyönteissoluja voidaan käyttää myös tuottamaan monimutkaisia eukaryoottisia proteiineja, joissa on oikeat posttranslationaaliset modifikaatiot. Hyönteisten ekspressiojärjestelmiä on kahdenlaisia; bakulovirusinfektoituja ja ei-lyyttisiä hyönteissoluja.

Baculovirus-ekspressiojärjestelmät ovat erittäin tehokkaita korkean tason rekombinanttiproteiinien ekspressioon. Nämä järjestelmät mahdollistavat hyvin monimutkaisten, glykosyloitujen proteiinien korkean ekspression, joita ei voida tuottaa E. coli- tai hiivasoluissa. Ainoa ongelma bakulovirusjärjestelmissä on se, että tartunnan saanut isäntäsolu lopulta lysoituu. Solun lyysi pysäyttää proteiinien tuotannon, mutta on olemassa ei-lyyttisiä hyönteissolujen ekspressiojärjestelmiä (sf9-, Sf21- ja Hi-5-solut), jotka mahdollistavat hyönteissolujen genomiin integroitujen geenien jatkuvan ekspression. Molemmat tämäntyyppiset hyönteisten ekspressiojärjestelmät voidaan skaalata suurten proteiinimäärien tuotantoa varten.

Hyönteissolujen ekspressiojärjestelmien haittapuolia ovat muun muassa se, että virustuotanto voi olla melko aikaa vievää ja että hyönteissolut vaativat vaativat vaativat viljelyolosuhteet, jotka ovat samanlaiset kuin nisäkkäiden ekspressiojärjestelmissä.

Bakteerien ekspressiojärjestelmät

Kun halutaan tuottaa valtavia määriä proteiineja nopeasti ja halvalla, bakteeriperäinen isäntäsolu on melkeinpä aina vastaus. E. coli on varmasti yksi suosituimmista isäntäsoluista proteiinien ilmentämiseen, ja sillä on useita proteiinien ilmentämiseen erikoistuneita kantoja. Proteiinien ilmentäminen bakteereissa on melko yksinkertaista; kiinnostavaa proteiinia koodaava DNA lisätään plasmidi-ilmentymisvektoriin, joka sitten transformoidaan bakteerisoluun. Transformoidut solut lisääntyvät, indusoidaan tuottamaan haluamaasi proteiinia ja lysoidaan sitten. Proteiini voidaan sitten puhdistaa solujätteestä.

On olemassa useita suosittuja DNA-vektoreita, joita voidaan käyttää suurten proteiinimäärien tuottamiseen bakteerisoluissa: esimerkiksi pET-, pRSET-, Gateway pDEST- ja pBAD-vektorit. Proteiinin ilmentymistä jokaisesta näistä vektoreista ohjaa eri promoottori, mikä johtaa eri ilmentymistasoihin kussakin vektorissa; alhaisempi ilmentyminen voi olla tarpeen, jos proteiinisi on myrkyllinen E. coli -bakteerille. Kaikista vektoreista T7 lac-promoottorin ohjaama ja laktoosin indusoima pET tarjoaa korkeimman proteiinin ilmentymistason.

Käytön helppoudesta huolimatta on tärkeää huomata, että bakteerit eivät yleensä pysty tuottamaan toimivia nisäkäsproteiineja, koska bakteerisolut eivät ole varustautuneet lisäämään asianmukaisia translaation jälkeisiä modifikaatioita. Lisäksi monet bakteerien tuottamat proteiinit muuttuvat liukenemattomiksi muodostaen inkluusiokappaleita, joita on vaikea uuttaa ilman kovia reagensseja ja kärsivällisyyttä.

Kasvien ekspressiojärjestelmät

Kasvit tarjoavat halvan ja matalan teknologian keinon rekombinanttiproteiinien massaekspressioon. Proteiinien ilmentämiseen on käytetty monia soluja erityyppisistä kasveista, kuten maissista, tupakasta, riisistä, sokeriruo’osta ja jopa perunan mukuloista.

Kasvijärjestelmillä on monia samoja ominaisuuksia ja prosessointivaatimuksia kuin nisäkässolujen ekspressiojärjestelmillä, mukaan lukien suurin osa monimutkaisista posttranslationaalisista modifikaatioista. Rekombinanttiproteiinien uuttaminen ja puhdistaminen kasveista voi kuitenkin olla kallista ja aikaa vievää, koska kasvikudokset itsessään ovat biokemiallisesti monimutkaisia.

Näiden ongelmien kiertämiseksi tutkijat ovat hyödyntäneet biokemikaalien ja proteiinien luonnollista eritystä kasvien juurten kautta. Merkitsemällä rekombinanttiproteiinit luonnollisesti erittyvällä kasvipeptidillä päästään helpommin käsiksi haluttuun proteiiniin ja puhdistetaan se helpommin. Huolimatta siitä, että kyseessä on melko nuori teknologia, kasvisoluja on käytetty ilmentämään monenlaisia proteiineja, mukaan lukien vasta-aineita ja lääkeaineita, erityisesti interleukiineja.

Kasvisolujen ilmentämisjärjestelmät

Kasvisolut ovat loistava ilmentämisjärjestelmä, jonka avulla voidaan tuottaa suuria määriä rekombinantteja eukaryoottisia proteiineja. Vaikka monia hiivalajeja voidaan käyttää proteiinien ilmentämiseen, S. cerevisiae on luotettavin ja eniten käytetty laji, koska sitä käytetään malliorganismina genetiikassa ja biokemiassa.

Käyttäessään S. cerevisiae -hiivaa tutkijat asettavat usein rekombinanttiproteiinit galaktoosi-indusoituvan promoottorin (GAL) ohjaukseen. Muita yleisesti käytettyjä promoottoreita ovat fosfaatti- ja kupari-indusoituvat promoottorit PHO5 ja CUP1. Hiivasoluja kasvatetaan tarkoin määritellyissä väliaineissa, ja ne voidaan helposti mukauttaa fermentointiin, mikä mahdollistaa proteiinien laajamittaisen ja vakaan tuotannon.

Yleisesti hiivan ekspressiojärjestelmät ovat helpompia ja halvempia käyttää kuin nisäkässolut, ja niillä pystytään usein muokkaamaan monimutkaisia proteiineja toisin kuin bakteerijärjestelmillä. Hiivasolujen kasvunopeus on kuitenkin hitaampi kuin bakteerisolujen, ja viljelyolosuhteet on usein optimoitava. Hiivasolut ovat myös tunnettuja siitä, että ne hyperglykosyloivat proteiineja, mikä voi olla ongelma riippuen valitsemastasi proteiinista.

Soluista vapaat ekspressiojärjestelmät

Soluista vapaissa ekspressiojärjestelmissä proteiinit kootaan in vitro käyttäen puhdistettuja transkriptio- ja translaatiokoneiston osia. Näitä ovat ribosomit, RNA-polymeraasi, tRNA:t, ribonukleotidit ja aminohapot. Soluvapaat ekspressiojärjestelmät ovat ihanteellisia useamman kuin yhden proteiinin nopeaan kokoamiseen yhdessä reaktiossa. Näiden järjestelmien suurena etuna on niiden kyky koota proteiineja, joissa on leimattuja tai muunnettuja aminohappoja, jotka ovat käyttökelpoisia erilaisissa jatkojalostussovelluksissa. Soluvapaat ekspressiojärjestelmät ovat kuitenkin kalliita ja teknisesti erittäin haastavia käyttää.

Alyssa D. Cecchetelli on Addgenen tutkija. Hän on väitellyt tohtoriksi Northeastern Universitystä ja on erityisen kiinnostunut solujen signaloinnista ja viestinnästä. Hän rakastaa sitä, että voi auttaa tiedeyhteisöä jakamaan plasmideja.

Lisälähteet

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Rekombinanttiproteiinien ilmentäminen Escherichia coli -bakteerissa: edistysaskeleet ja haasteet
• Rekombinanttiproteiinien tuotanto kasvien juurten eksudaateissa