Nisäkkäiden heksokinaasin isosyymit: rakenne, subcellulaarinen lokalisaatio ja metabolinen toiminta | Journal of Experimental Biology
Tyypin I isotsyymi
Kuten kuvasta 1 käy ilmi, heksokinaasi toimii porttina, jonka kautta Glc pääsee vaihtoehtoisiin metaboliareitteihin. Siitä huolimatta on luultavasti turvallista sanoa, että heksokinaasia pidetään yleisimmin glykolyyttisenä entsyyminä, ja glykolyyttistä aineenvaihduntaa pidetään yleisesti sytoplasmisena prosessina. Näin ollen oli huomattavaa, että toisin kuin muiden glykolyyttisten entsyymien kohdalla, heksokinaasiaktiivisuutta (jonka tiedetään nykyään olevan tyypin I isotsyymi) löydettiin pääasiassa aivohomogenaattien ”partikkelifraktioista” (Crane ja Sols, 1953). Myöhemmät työt (Johnson, 1960; Rose ja Warms, 1967; ks. myös Wilson, 1995) osoittivat, että hiukkasmainen heksokinaasi liittyi mitokondrioihin ja tarkemmin sanottuna mitokondrioiden ulompaan kalvoon (Rose ja Warms, 1967; Kropp ja Wilson, 1970).Sitoutuminen on ratkaisevasti riippuvainen hydrofobisesta N-terminaalisesta sekvenssistä (Polakis ja Wilson, 1985), joka valikoivasti kohdistaa tyypin I isotsyymin mitokondrioihin (Gelb ym.), 1992; Sui ja Wilson, 1997), ja se asettuu sitoutumisen aikana mitokondrioiden ulomman kalvon hydrofobiseen ytimeen (Xie ja Wilson, 1988). Poriini (jota kutsutaan myös nimellä `VDAC’, joka on lyhenne sanoista `voltagedependent anion channel’ (jännitteestä riippuvainen anionikanava)) muodostaa kanavan, jonka kautta aineenvaihduntatuotteet kulkevat ulomman mitokondriokalvon läpi, ja se tunnistettiin ulomman mitokondriokalvon proteiiniksi, joka on vuorovaikutuksessa heksokinaasin kanssa (Felgner et al., 1979;Lindén et al., 1982;Fiek et al., 1982). Lisäksi on näyttöä siitä, että heksokinaasin sitoutuminen tapahtuu ensisijaisesti poriineihin, jotka sijaitsevat kontaktipaikoissa, alueilla, joilla sisäinen ja ulompi mitokondriokalvo ovat läheisessä kosketuksessa toisiinsa (Dorbani ym., 1987; Kottke ym., 1987),
Johnsonin (1960) sekä Rosen ja Warmsin (1967) klassisia tutkimuksia seurasivat pian raportit mitokondrioon sitoutuneesta heksokinaasista muista normaaleista kudoksista, aivojen lisäksi myös erilaisista kasvainsoluista (viitteitä, ks. Wilson, 1985,1995). Tämän ”glykolyyttisen” entsyymin ja mitokondrioiden, hapetusmetabolian ensisijaisen paikan, välisen yhteyden mahdollisesta fysiologisesta merkityksestä on spekuloitu paljon. Jo varhain ja erityisesti sen jälkeen, kun huomattiin, että mitokondrioiden ulomman kalvon ”heksokinaasia sitova proteiini” oli identtinen poriinin kanssa ja että heksokinaasi saattoi sijaita lähellä kohtaa, jossa ATP poistuu mitokondrioista (ja ADP tulee takaisin mitokondrioihin), Spekulaatiot keskittyivät pitkälti mahdollisuuteen, että tämä läheisyys saattaisi edistää intiimiä metabolista vuorovaikutusta intramitokondriaalisen oksidatiivisen fosforylaation välillä substraatin ATP:n lähteenä jaGlc-fosforylaation välillä mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin toimesta. Rose ja Warms (1967) olivat itse asiassa pohtineet tätä mahdollisuutta, mutta heidän kokeelliset tuloksensa eivät tukeneet sitä. Muiden myöhemmin tekemät työt (ks. viittaukset Wilson,1985,1995), joissa käytettiin eri lähteistä peräisin olevaa mitokondrioon sitoutunutta heksokinaasia, tuottivat kuitenkin todisteita sen näkemyksen tueksi, että mitokondrioon sitoutuneella heksokinaasilla oli ”etuoikeutettu” tai ”etuoikeutettu” pääsy titokondriossa tuotettuun ATP:hen.
Laboratoriossamme tehty työ on tarjonnut vankan perustan näkemykselle, jonka mukaan aktiivisesti fosforyloituviin aivojen mitokondrioihin sitoutunut heksokinaasi on todellakin tiiviisti kytkeytynyt substraatin ATP:n intramitokondriaaliseen lokeroon, joka on tuotettu oksidatiivisen fosforylaation avulla. Tämän päätelmän kokeellinen tuki on kuvattu useissa julkaisuissa (BeltrandelRio ja Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar ja Wilson, 1995,1998,2002;Hashimoto ja Wilson, 2000). Täydellinen katsaus tähän työhön ei ole mahdollista tässä yhteydessä, mutta korostamme joitakin tärkeimpiä havaintoja osoittaaksemme, että näissä tutkimuksissa on käytetty erilaisia kokeellisia lähestymistapoja, jotka kaikki ovat johtaneet samaan lopputulokseen.
Alustavat tutkimukset (BeltrandelRio ja Wilson,1991,1992a,b)tehtiin käyttäen spektrofotometrisiä menetelmiä, joissa ATP:n tuotanto erilaisilla intramitokondriaalisilla prosesseilla (oksidatiivinen fosforylaatio, adenylaattikinaasireaktio, kreatiinikinaasireaktio) ja heksokinaasin suorittama Glc-fosforylaatio yhdistettiin NADPH:n tuotantoon, jota seurattiin 340 nm:ssä sopivien kytkentäentsyymien käytöllä. Perusajatuksena oli, että vertaamalla glk-fosforylaation nopeutta eri lähteistä peräisin olevan ATP:n tuotantonopeuteen voitaisiin päätellä erilaisten intramitokondriaalisten ATP:tä tuottavien prosessien suhteellinen merkitys heksokinaasin ATP:n substraattilähteenä. Johtopäätös oli, että oksidatiivisen fosforylaation tapahtuessa sen enempää adenylaattikinaasi kuin kreatiinikinaasikaan ei ollut merkittävä substraattiATP:n lähde. Lisäksi heksokinaasi käytti vain murto-osan oksidatiivisen fosforylaation tuottamasta ATP:stä, minkä seurauksena ekstramitokondriaalisessa väliaineessa lisääntyi edelleen oksidatiivisen fosforylaation jatkuessa. Glc-fosforylaation nopeus ei kuitenkaan kasvanut tasaisesti ekstramitokondriaalisen ATP:n jatkuvan lisääntymisen seurauksena huolimatta siitä, että jälkimmäinen oli verrattavissa ATP:n Km-arvoon, joka nähtiin ekstramitokondriaalisen ATP:n lisäyksellä ilman oksidatiivista fosforylaatiota, eli heksokinaasi ei olisi ”kyllästynyt” ekstramitokondriaalisella ATP:llä substraattina (kuva 2). Tämä viittasi vahvasti siihen, että substraattina ei käytetty ekstramitokondriaalista ATP:tä.
Glukoosin (Glc) fosforylaatio glukoosi-6-fosfaatiksi (Glc-6-P) mittokondrioon sitoutuneen heksokinaasin toimesta eksogeenisella ATP:llä tai oksidatiivisen fosforylaation tuottamalla ATP:llä. Glc-fosforylaation nopeus määritettiin ekvivalenttina , joka lisättiin joko eksogeenisesti ilman oksidatiivista fosforylaatiota (kolmiot) tai tuotettiin oksidatiivisella fosforylaatiolla (ympyrät). Kummastakin lähteestä peräisin oleva glc-fosforylaationopeus oli vajaakyllästävä, ja glc-fosforylaationopeus oli huomattavasti alhaisempi kuin silloin, kun ATP-tasoja nostettiin akuutisti lisäämällä tyydyttäviä määriä eksogeenista ATP:tä (neliöt). Jäljennetty luvalla lähteestä BeltrandelRio ja Wilson(1991).
Lisäistä tukea tälle antoivat kuvassa 3 esitettyjen tulosten kaltaiset tulokset. Tässä Glc-fosforylaatiota seurattiin sen jälkeen, kun oksidatiivinen fosforylaatio oli aloitettu lisäämällä ADP:tä, kun ekstramitokondriaalisen ATP:n pitoisuudet kasvoivat alusta alkaen. Kuten klassisen Michaelis-Mentenkinetiikan perusteella odotetaan, Glc-fosforylaation alkunopeus kasvoi ekstramitokondriaalisen . Ajan myötä saavutettiin kuitenkin Glc-fosforylaation tasainen nopeus, joka oli riippumaton jäljellä olevan ekstramitokondriaalisen ATP:n määrästä. Näiden tulosten tulkittiin osoittavan, että vaikka mitokondrioon sitoutunut heksokinaasi käytti aluksi ekstramitokondriaalista ATP:tä, oksidatiivisen fosforylaation käynnistyminen johti substraattipreferenssin muuttumiseen, jolloin heksokinaasi tuli riippuvaiseksi intramitokondriaalisesta ATP:stä, joka määräytyi oksidatiivisen fosforylaation nopeuden mukaan ja oli riippumaton ekstramitokondriaalisesta ATP:n määrästä.
Glukoosin (Glc) fosforylaatio mitokondrioon sitoutuneella heksokinaasilla ja hapettuvalla fosforylaatiolla tuotettu ATP kasvavien eksogeenisen ATP:n pitoisuuksien läsnä ollessa. ATP:n tuotanto oksidatiivisella fosforylaatiolla aloitettiin lisäämällä ADP:tä ilmoitettuna ajankohtana. Glc-fosforylaatio kytkettiin NADPH:n tuotantoon, jota seurattiin absorbanssilla 340 nm:ssä (A) ylimääräisen glukoosi-6-fosfaatti (Glc-6-P) dehydrogenaasin läsnä ollessa. Eksogeenisen ATP:n pitoisuudet, jotka olivat läsnä ADP:n lisäyshetkellä, olivat vastaavasti 1,1, 0,66, 0,22 ja 0 mmol l-1 käyrille A-D. Huomaa, että saavutettu vakaa tila oli riippumaton alkuperäisestä ekstramitokondriosta. Jäljennetty luvalla lähteestä BeltrandelRio jaWilson (1992b).
Vaikka ATP:n tuotanto alkoi lähes välittömästi sen jälkeen, kun oksidatiivinen fosforylaatio oli käynnistynyt ADP:n lisäyksellä, mitokondrioon sidotun heksokinaasin suorittama Glc-fosforylaation käynnistyminen viivästyi huomattavasti (kuva 3D), ennen kuin vakaan tilan nopeus saavutettiin, joka säilyi pitkän aikaa. Tämän alkuvaiheen viiveen tulkittiin olevan aika, joka tarvitaan titokondrionsisäisen osaston täyttämiseen ATP:llä, joka on tuotettu oksidatiivisella fosforylaatiolla ja josta titokondrioon sitoutunut heksokinaasi on ottanut substraattinsa ATP:n. Tämä viive oli kuitenkin pitkä. Elektronin kuljetuksen estäminen lisäämällä KCN:ää johti ATP:n ilmeiseen vapautumiseen, oletettavasti intramitokondriaalisesta osastosta, ja tämän ”osaston” ominaisuudet (täyttymisen kinetiikka, yhteys intramitokondriaaliseen ATP-tuotantoon jne.) vastasivat tyydyttävästi tähän tulkintaan perustuvia odotuksia (BeltrandelRio ja Wilson,1991,1992a,b).Valitettavasti odotusten kanssa yhtäpitävyys ei ole erehtymätön opas totuudenmukaisuuden suhteen, ja ATP:n ”näennäinen vapautuminen” todettiin sittemmin väärennökseksi (Laterveer ym.,1993).), jonka lähdettä ei vieläkään ymmärretä ja jota ei voitu jäljentää myöhemmissä töissä (deCerqueira Cesar ja Wilson, 1998). Tästä lannistavasta ja kiusallisesta takaiskusta huolimatta peruskonsepti mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin kytkemisestä intramitokondriaaliseen ATP:n lokeroon sai tukea muusta todistusaineistosta, ja se on kestänyt myöhemmät kokeelliset testit.
Vaihtoehtona spektrofotometrisille menetelmille kehitettiin kaksoisisotooppimerkintämenetelmä (deCerqueira Cesar ja Wilson, 1995). 14C-leimattua Glc:tä käytettiin heksokinaasin substraattina, ja 32Pi toimitti substraatin ATP-synteesiin oksidatiivisen fosforylaation avulla. Glc-6-P:n 32P/14C-suhde tarjosi siten heksokinaasin käyttämän substraatin ATP:n spesifisen aktiivisuuden mittarin. Mitokondrioihin sitoutuneen heksokinaasin tuottaman Glc-6-P:n32P/14C-suhdetta verrattiin hiivaheksokinaasin tuottamaan Glc-6-P:hen, joka ei sitoudu mitokondrioihin ja käyttää näin ollen välttämättä ekstramitokondriaalistaATP:tä substraattina. Mitokondrioihin sitoutuneiden ja hiivaheksokinaasien substraattina käyttämien ATP-altaiden merkitsemisen kinetiikka oli silmiinpistävän erilainen, mikä on jälleen johdonmukaista sen näkemyksen kanssa, että mitokondrioihin sitoutunut heksokinaasi ei käyttänyt ekstramitokondriaalista ATP:tä substraattina, vaan pikemminkin hyödynsi oksidatiivisen fosforylaation tuottamaa ATP:tä intramitokondriaalisesta ATP:n osastosta.Esimerkiksi (kuva 4) ylimääräisen 31Pi:n lisääminen ja siten hapettuvassa fosforylaatiossa syntetisoidun 32P-ATP:n spesifisen aktiivisuuden huomattava vähentäminen johti hiivan heksokinaasin tuottaman glc-6-P:n 32P/14C-suhteen nopeaan pienenemiseen ekstramitokondriaalisen ATP:n avulla. Sen sijaan mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin tuottaman Glc-6-P:n 32P/14C-suhde laski viiveellä ja sen jälkeen hieman hitaammin. Jälkimmäiset havainnot olivat jälleen sopusoinnussa sen näkemyksen kanssa, että mitokondriaalinen heksokinaasi käytti intramitokondriaalista ATP-osastoa, joka ei ollut vapaasti tasapainossa ekstramitokondriaalisen ATP:n kanssa.
Ylimääräisen leimaamattoman Pi:n lisäämisen vaikutusmitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin tai ei-mitokondrioon sitoutuneen hiivaheksokinaasin muodostaman glukoosi-6-fosfaatin (Glc-6-P)32P/14C-suhteeseen.Oksidatiivinen fosforylaatio aloitettiin 32Pi:llä, joka oli substraattina oksidatiiviselle fosforylaatiolle, ja Glc:llä, joka oli heksokinaasin assubstraattina. 3 minuutin kuluttua lisättiin ylimääräistä 31Pi:tä, mikä vähensi oksidatiivisella fosforylaatiolla myöhemmin tuotetun ATP:n spesifistä aktiivisuutta. Tämä johti siihen, että hiivan heksokinaasin (neliöt) muodostaman Glc-6-P:n 32P/14C-suhde laski jyrkästi, kun se käytti ekstramitokondriaalista ATP:tä substraattina, mutta mikrotokondrioon sitoutuneen heksokinaasin (avoimet ympyrät) tuottaman Glc-6-P:n 32P/14C-suhde laski paljon hitaammin. Täytetyt ympyrät, mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin tuottama Glc-6-P:n kokonaismäärä. Jäljennetty luvalla lähteestä de Cerqueira Cesar ja Wilson(1995).
Toinen kokeellinen lähestymistapa perustui titokondrioon sitoutuneen heksokinaasin ja sitoutumattoman hiivaentsyymin vertailuun (de CerqueiraCesar ja Wilson, 1998,2002). Taustalla oleva logiikka on esitetty kuvassa 5. Kiinteä määrä aivojen mitokondrioita, joissa on sitoutunutta heksokinaasia, sekoitetaan kasvavaan määrään rotan maksan mitokondrioita, jotka eivät sisällä sitoutunutta heksokinaasia. Sekä aivojen että maksan mitokondriot fosforyloituvat aktiivisesti, joten ATP:n tuotantonopeus järjestelmässä kasvaa, kun maksan mitokondrioiden määrää lisätään. Suunnitelmallisesti ekstramitokondriaalisen ATP:n konsentraatio pidetään vajaakyllästyneenä, eli heksokinaasin ÅKm:n ja ekstramitokondriaalisen ATP:n ollessa substraattina (ilman oksidatiivista fosforylaatiota). Jos mitokondrioon sitoutunut heksokinaasi käyttää substraattina ekstramitokondriaalista ATP:tä, Glc-fosforylaationopeuden odotetaan kasvavan asteittain, kun ATP:n tuotantonopeutta nostetaan lisäämällä kasvavia määriä maksan mitokondrioita. Itse asiassa näin ei ole havaittu, vaan ATP:n tuotantonopeuden kasvu ei vaikuta merkittävästi heksokinaasiin sitoutuneen heksokinaasin suorittaman Glc-fosforylaation nopeuteen (kuva 6). Sitä vastoin Glc-fosforylaationopeus kasvaa odotetusti, jos mitokondriaalinen heksokinaasi korvataan vastaavalla määrällä hiivaheksokinaasia. Nämä tulokset ovat näin ollen jälleen sopusoinnussa sen näkemyksen kanssa, että mitokondrioon sitoutunut heksokinaasi käyttää intramitokondriaalista ATP:tä, joka on ominaista niille mitokondrioille, joihin heksokinaasi liittyy, mutta joka on riippumaton heksokinaasivapaista maksimitokondrioista peräisin olevasta ekstramitokondriaalisen ATP:n lisääntymisestä.
Kaavamainen esitys kokeellisesta strategiasta ekstramitokondriaalisen ATP:n käytön vertailemiseksi mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin tai sitoutumattoman hiivaheksokinaasin avulla. (A) Mitokondriaalisesti sitoutunut heksokinaasi (HK) on esitetty paneelin keskellä, ja lisämitokondrioita, jotka sisältävät vähän tai ei lainkaan sitoutunutta heksokinaasia, on esitetty reuna-alueilla.Jälkimmäistä varten käytettiin rotan aivojen mitokondrioita, jotka oli tyhjennetty heksokinaasista käsittelemällä niitä glukoosi-6-fosfaatilla, joka aiheuttaa niiden sitoman heksokinaasin vapautumisen, aikaisemmissa kokeissa. Myöhemmissä kokeissa käytettiin kuitenkin rotan maksan mitokondrioita, jotka eristettyinä eivät sisällä sitoutunutta heksokinaasia. Ekstramitokondriaalinen ATP jakautuu koko ekstramitokondriotilaan. (B) Analoginen tilanne, mutta vastaava määrä ei-mitokondriaalisesti sitoutunutta hiivaheksokinaasia (YHK) sitomattoman heksokinaasin sijasta. Perusstrategia on määrittää glukoosin fosforylaationopeus kiinteällä määrällä sitoutunutta tai sitoutumatonta heksokinaasia, kun ekstramitokondriaalisen ATP:n tuotannon nopeutta kasvatetaan lisäämällä kasvava määrä mitokondrioita, joissa ei ole sitoutunutta heksokinaasia. Jäljennetty julkaisun de Cerqueira Cesar ja Wilson(2002) luvalla.
Glukoosin (Glc) fosforylaation nopeus mitokondrioon sitoutuneella ja sitoutumattomalla heksokinaasilla, kun ATP:n tuotanto lisääntyy oksidatiivisesta fosforylaatiosta. Glc-fosforylaationopeus (v̇) ilmaistaan suhteessa maksimaaliseen fosforylaationopeuteen (V̇), joka määritetään tyydyttävillä eksogeenisen ATP:n määrillä ilman oksidatiivista fosforylaatiota. Glc-6-P:n tuotantonopeus ei-mitokondriaalisesti sitoutuneen hiivaheksokinaasin (ympyrät) avulla korreloi läheisesti ATP:n tuotantonopeuden kanssa. Sitä vastoin mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin Glc-fosforylaationopeus (neliöt) ei ole herkkä ekstramitokondriaalisen ATP:n lisääntyvälle määrälle, jota ei-heksokinaasia sisältävät mitokondriot tuottavat, mikä on johdonmukaista sen näkemyksen kanssa, että mitokondrioon sitoutunut entsyymi käyttää substraattina vain intramitokondriaalista ATP:tä, jota tuottavat mitokondriot, joihin entsyymi on sitoutunut. Jäljennetty luvalla lähteestä de Cerqueira Cesar ja Wilson (1998).
Loppujen lopuksi lisänäyttöä näkemykselle, jonka mukaan mitokondrioon sitoutunut heksokinaasi voi erottaa intra- ja ekstramitokondriaalisen ATP:n toisistaan, saadaan tarkastelemalla Glc-6-P-analogin, 1,5-Anhydroglukitoli-6-P:n (1,5-AnG6P:n), aiheuttamaa inhibitiota. Ilman oksidatiivista fosforylaatiota ja ekstramitokondriaalisen ATP:n ollessa substraattina 1,5-AnG6P on melko voimakas inhibiittori, joka kilpailee ATP:n kanssa (kuva 7) (Hashimoto ja Wilson, 2000). Sitä vastoin, kun ATP:tä syötetään oksidatiivisen fosforylaation avulla, 1,5-AnG6P on paljon tehottomampi inhibiittori. On selvää, että oksidatiivisen fosforylaation tuottama ATP ei vastaa ekstramitokondriaalista ATP:tä. Samankaltaisia tuloksia on hiljattain raportoitu käyttämällä naudan aivoista peräisin olevaa heksokinaasia (de Cerqueira ja Wilson,2002).
Mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin estäminen glukoosi-6-fosfaattianalogilla, 1,5-anhydroglukitoli-6-P:llä (1,5-AnG6P), intramitokondriaalisesti generoidulla (avoimet ympyrät) tai ekstramitokondriaalisella (täytetyt ympyrät) ATP-assubstraatilla. Jäljennetty luvalla lähteestä Hashimoto ja Wilson(2000).
Lyhyesti sanottuna nykyinen näkemys on, että ilman oksidatiivista fosforylaatiota mitokondriaalinen heksokinaasi voi helposti käyttää ekstramitokondriaalistaATP:tä klassisen Michaelis-Mentenin kinetiikan mukaisesti. Aktiivisen oksidatiivisen fosforylaation aikana mitokondrioon sitoutunut entsyymi on kuitenkin kytketty intramitokondriaaliseen ATP-varastoon, ja Glc-fosforylaation nopeus korreloi läheisesti oksidatiivisen fosforylaation nopeuden kanssa.Vaikuttaa vaikealta uskoa, että normaaleissa kudoksissa mitokondriot ovat koskaan täysin fosforyloimattomassa tilassa. Muutokset nopeudessa? Kyllä, tietysti, energiantarpeen vaihteluiden mukaan. Mutta todella fosforyloimattomassa tilassa? luultavasti vain kaikkein vaikeimmissa – ja viime kädessä tappavissa – olosuhteissa. Tästä seuraa, että normaalioloissa Glc-fosforylaationopeus on tiiviisti koordinoitu mitokondrioissa tapahtuvan Glcmetabolian hapettumisen loppuvaiheiden kanssa, joihin liittyy ATP:n tuottaminen hapettuvan fosforylaation avulla. Kuten aiemmin on todettu (BeltrandelRio ja Wilson,1992a), tällainen koordinointi voi varmistaa Glc:n johtamisen glykolyyttiseen aineenvaihduntaan nopeudella, joka on sopusoinnussa terminaalisten oksidatiivisten vaiheiden kanssa, jolloin vältetään neurotoksisen laktaatin tuotanto (Marie ja Bralet, 1991) ja samalla varmistetaan nettovirtaus sytoplasman ja mitokondrioiden kautta riittävän nopeasti, jotta energiantarve voidaan tyydyttää (kuva 8).
Glukoosin (Glc)aineenvaihdunnan glykolyyttisten ja oksidatiivisten vaiheiden koordinointi. Mitokondrioon sitoutuneen heksokinaasin suorittaman Glc-fosforylaation nopeus, joka käyttää substraattina intramitokondriossa syntyvää ATP:tä, korreloi oksidatiivisen fosforylaation nopeuden kanssa. Tämän mekanismin oletetaan varmistavan Glc-fosforylaation, joka on glykolyyttisen aineenvaihdunnan alkuvaihe, koordinoinnin mitokondrioissa tapahtuvien lopullisten hapettumisvaiheiden (trikarboksyylihappokierto ja siihen liittyvä elektroninsiirto ja oksidatiivinen fosforylaatio; lihavoidut kaarevat nuolet) kanssa, jolloin vältetään mahdollisesti myrkyllisen laktaatin kertyminen.
Ei tiedetä, miten tämä huomattava muutos substraattispesifisyydessä (intramitokondriaalinen vs. ekstramitokondriaalinen ATP) aiheutuu oksidatiivisesta fosforylaatiosta, mutta on selvää, että mitokondrioon sitoutuneen entsyymin konformaatioon vaikuttavat mitokondriaalinen kalvopotentiaali sekä muut mitokondrioiden toimintaan liittyvät tekijät, mikä viittaa läheiseen vuorovaikutukseen tämän organellin sisemmän (jonka yli kalvopotentiaali kulkee) ja ulomman (johon heksokinaasi on sitoutunut) kalvon välillä (Hashimoto ja Wilson, 2000).Muodonmuutosten, jotka vaikuttavat molekyylin alueisiin, jotka osallistuvat substraatin ATP:n sitomiseen, on aiemmin oletettu (de Cerquiera ja Wilson, 1998) olevan vastuussa substraattispesifisyyden muutoksista.