Modafiniilin vaikutukset käyttäytymiseen ja oksidatiivisen vaurion parametreihin Wistar-rottien aivoissa
Abstract
Modafiniilin (MD) vaikutukset käyttäytymiseen ja proteiinien ja lipidien oksidatiiviseen vaurioon rottien aivoissa arvioitiin. Wistar-rotille annettiin kerta-annoksena nielemällä vettä tai MD:tä (75, 150 tai 300 mg/kg). Käyttäytymisparametrit arvioitiin avoimessa kenttälaitteessa 1, 2 ja 3 tuntia lääkkeen antamisen jälkeen. Aivoista mitattiin tiobarbituurihapon reaktiiviset aineet (TBARS) ja proteiinikarbonyylien muodostuminen. MD lisäsi liikunta-aktiivisuutta suurimmalla annoksella 1 ja 3 tuntia antamisen jälkeen. MD:n antaminen annoksella 300 mg/kg lisäsi käyntejä avoimen kentän keskellä 1 h antamisen jälkeen. 3 h antamisen jälkeen kaikki annetut MD-annokset lisäsivät kuitenkin käyntejä avoimen kentän keskellä. MD 300 mg/kg lisäsi lipidivaurioita amygdalassa, hippokampuksessa ja striatumissa. Lisäksi MD lisäsi proteiinivaurioita prefrontaalisessa aivokuoressa, amygdalassa ja hippokampuksessa; tämä vaikutus vaihtelee kuitenkin annetusta annoksesta riippuen. Sitä vastoin MD:n antaminen 75 ja 300 mg/kg vähensi proteiinivaurioita striatumissa. Tämä tutkimus osoitti, että MD:n antaminen aiheuttaa käyttäytymismuutoksia, jotka riippuivat käytetystä annoksesta. Lisäksi MD:n vaikutukset oksidatiivisten vaurioiden parametreihin näyttivät olevan tietyillä aivoalueilla ja annoksilla.
1. Johdanto
Modafiniili (MD) on ei-amfetaminerginen psykoaktiivinen lääke, jota määrätään usein unihäiriöiden, kuten narkolepsian, obstruktiivisen uniapneaoireyhtymän ja vuorotyön unihäiriön hoitoon . Lisäksi kirjallisuudessa on hyvin kuvattu, että MD parantaa toimintoja useilla kognitiivisilla osa-alueilla sekä työmuistia ja episodista muistia . Näitä MD:n vaikutuksia muistiin on kuvattu myös psykiatrisilla potilailla, mikä viittaa siihen, että tämä lääke on erinomainen kandidaatti psykiatristen häiriöiden kognitiivisten toimintahäiriöiden hoitoon . Lisäksi kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että MD parantaa oireita potilailla, joilla on vaikea masennus, kaksisuuntainen mielialahäiriö, skitsofrenia ja tarkkaavaisuus-/hyperaktiivisuushäiriö (ADHD) .
MD:n vaikutusmekanismi tunnetaan huonosti; tiedetään kuitenkin, että tällä lääkkeellä on tärkeä vaikutus katekoliamiini-, serotoniini-, glutamaatti-, gamma-aminovoihappo-, oreksiini- ja histamiinijärjestelmiin aivoissa . Lisäksi tutkimukset osoittavat, että MD estää dopamiinin kuljettajaa, mikä lisää dopaminergistä neurotransmissiota tarkkaavaisuuspiireissä . Psykostimulanttien, kuten amfetamiinin, jotka vaikuttavat myös erilaisiin välittäjäainejärjestelmiin, on osoitettu vaikuttavan voimakkaasti käyttäytymiseen, mukaan lukien pelon, ahdistuksen ja hyperaktiivisuuden syntyminen . MD:hen liittyy kuitenkin vähemmän sivuvaikutuksia, kuten hyperaktiivisuutta, ahdistuneisuutta, hermostuneisuutta tai rebound-vaikutuksia, kuin perinteisiin stimulantteihin .
Monissa tutkimuksissa ehdotettiin, että psykostimulanttien antaminen voi johtaa oksidatiiviseen stressiin rotan aivoissa . Aivot ovat erityisen alttiit reaktiivisten happilajien (ROS) tuotannolle, koska niissä metaboloituu 20 % kehon kokonaishapesta ja niiden antioksidanttikapasiteetti on rajallinen . Psykostimulanttien, kuten metyylifenidaatin, m-amfetamiinin ja d-amfetamiinin, krooninen anto rotilla aiheutti lisääntynyttä superoksidituotantoa, proteiinien, lipidien ja DNA:n hapettumisvaurioita sekä muutoksia entsyymien antioksidanttien ja mitokondriaalisen hengitysketjun komplekseissa .
Sentähden tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida MD:n vaikutusta käyttäytymiseen ja oksidatiivisen stressin parametreihin rottien hippokampuksessa, prefrontaalisessa aivokuoressa, amygdalassa ja striatumissa.
2. Kokeelliset menetelmät
2.1. Tutkimusmenetelmät. Eläimet
Koehenkilöt olivat aikuisia urospuolisia Wistar-rotteja (paino 250-350 g), jotka saatiin kasvatussiirtokunnastamme. Eläimiä säilytettiin viisi häkissä, joissa ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum, ja niitä pidettiin 12 tunnin valo-/pimeäjaksolla (valot päällä klo 7:00) lämpötilassa °C. Kaikki kokeelliset toimenpiteet suoritettiin Universidade do Extremo Sul Catarinensen paikallisen eläinten käyttöä käsittelevän eettisen komitean hyväksynnän mukaisesti. Kaikki kokeet suoritettiin samaan aikaan vuorokauden aikana vuorokausivaihteluiden välttämiseksi.
2.2. Kokeet, jotka on suoritettava, on esitetty seuraavassa taulukossa. Lääkkeet ja farmakologiset menetelmät
MD (Libbs Farmacêutica Ltda) suspendoitiin ajoneuvoon-ajoneuvoon: 1 % metyyliselluloosaa vedessä. Liuokset valmistettiin välittömästi ennen käyttöä ja suojattiin valolta koejakson aikana. Suspendoitua liuosta sekoitettiin koko injektiojakson ajan. Kontrolliryhmä sai Vehikkeliä.
2.3. Koejärjestely
Kokeessa käytettyjen rottien kokonaismäärä oli 40 ( eläintä ryhmää kohti). Eläimet saivat kerta-annoksen MD:tä (75, 100 tai 300 mg/kg ruumiinpainoa) tilavuudessa 1 ml/kg, joka annettiin nieltynä. Kontrolliryhmä sai lääkettä tilavuudeltaan 1 ml/kg. Lokomotorinen aktiivisuus mitattiin 1, 2 ja 3 tuntia injektion jälkeen, ja rotat lopetettiin dekapitaatiolla heti avoimen kentän tehtävän jälkeen.
2.4. Lokomotorinen aktiivisuus
Lokomotorinen aktiivisuus arvioitiin käyttämällä avoimen kentän tehtävää aiemmin kuvatulla tavalla . Tehtävä suoritettiin 40 × 60 cm:n kokoisessa avoimessa kentässä, jota ympäröivät 50 cm:n korkuiset seinät, jotka oli tehty ruskeasta vanerista, ja lattia oli jaettu yhdeksään yhtä suureen neliöön mustilla viivoilla. Eläimet asetettiin varovasti vasempaan takimmaiseen suorakulmioon, ja niiden annettiin tutkia areenaa vapaasti 5 minuutin ajan. Avoimen kentän testissä arvioitiin seuraavia käyttäytymisparametreja.
Ylitykset (lokomotorinen aktiivisuus/horisontaalinen aktiivisuus): rottien koko testijakson aikana ylittämien ruutujen kokonaismäärä laskettiin.
Taka-asennot (eksploratiivinen aktiivisuus/vertikaalinen aktiivisuus): rottien koko testijakson aikana pystyasennossa olleiden rottien kokonaismäärä laskettiin.
Käynnit avoimen kentän keskipisteessä: käyntien kokonaismäärä avoimen kentän keskipisteessä laskettiin. Keskellä oleva cm:n neliö määriteltiin kentän ”keskustan” alueeksi.
2.5. Oksidatiivisen vaurion merkkiaineiden mittaaminen
Kissoja käsiteltiin MD:llä tai vedellä edellä kuvatulla tavalla, ja ne lopetettiin dekapitaatiolla 3 h viimeisen injektion jälkeen, ja niiden aivot irrotettiin ja paloiteltiin oksidatiivisen vaurion tasojen arvioimiseksi prefrontaalisessa aivokuoressa, amygdalassa, hippokampuksessa ja striatumissa. TBARS- ja proteiinikarbonyylimuodostumat mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla .
2.6. Tiobarbituurihapporeaktiiviset aineet (TBARS)
TBARS:n muodostuminen happolämmitysreaktion aikana mitattiin ROS-tuotannon indeksinä, joka on laajalti hyväksytty herkkänä menetelmänä lipidiperoksidaation mittaamiseksi, kuten aiemmin on kuvattu . Lyhyesti sanottuna näytteet sekoitettiin 1 ml:aan 10-prosenttista trikloorietikkahappoa (TCA) ja 1 ml:aan 0,67-prosenttista tiobarbituurihappoa (TBA) ja kuumennettiin sitten kiehuvassa vesihauteessa 15 minuutin ajan. TBARS määritettiin absorbanssilla 535 nm:ssä. Tulokset ilmaistaan MDA (malondialdehydi) -ekvivalentteina (nmol/mg proteiinia).
2.7. Proteiinikarbonyylien mittaaminen
Proteiinien hapettumisvaurioita arvioitiin määrittämällä karbonyyliryhmät perustuen reaktioon dinitrofenyylihydratsiinin (DNPH) kanssa aiemmin kuvatulla tavalla . Lyhyesti sanottuna proteiinit saostettiin lisäämällä 20-prosenttista trikloorietikkahappoa ja liuotettiin uudelleen DNPH:hen ja absorbanssi luettiin 370 nm:ssä.
2.8. Tilastollinen analyysi
Kaikki analyysit tehtiin yhteiskuntatieteiden tilastopaketin versiolla 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Ryhmien väliset erot käyttäytymisanalyyseissä todennettiin käyttämällä toistettujen mittausten varianssianalyysia, jotta päästiin käsiksi ajan vastekäyrään, jota seurasi Tukeyn post hoc -testit. Ryhmien välisten erojen testaamiseksi biokemiallisessa analyysissä käytimme ANOVA:ta, jota seurasivat Tukeyn post hoc -testit. Kaikissa kokeissa arvojen < 0,05 katsottiin osoittavan tilastollista merkitsevyyttä.
3. Tulokset
3.1. Tulokset
3. Käyttäytymisen analyysi
Käyttäytymisen (ylitykset) analyysissä (kuva 1(a)) toistettujen mittausten varianssianalyysi paljasti merkittäviä eroja MD:n antamisen (F(3.35) = 7.91, ) ja käyttäytymisen toistojen (F(2.7) = 54.82, ) osalta. Lisäanalyysi Tukeyn post hoc -testillä osoitti, että MD 300 mg/kg lisäsi rottien spontaania liikkumista kontrolliryhmään verrattuna 1 h antamisen jälkeen. Lisäksi kontrolliryhmässä, MD-annoksella 75 mg/kg ja MD-annoksella 150 mg/kg ylitysten määrä väheni, kun rotat altistettiin 3 tuntia myöhemmin uudelleen avoimelle kentälle, mikä osoittaa tottumista ympäristöön. MD-annoksella 300 mg/kg hoidetuilla rotilla ylitysten määrä kuitenkin väheni, kun ne altistettiin uudelleen avoimelle kentälle 2 ja 3 tuntia myöhemmin. Tämä ero voi selittyä motorisella hyperaktiivisuudella, joka aiheutui 1 tunti MD:n antamisen jälkeen annoksella 300 mg/kg.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Exploraatioanalyysin (peräännyttämiset) (kuva 1(b)) toistettujen mittausten varianssianalyysi paljasti merkitseviä eroja käyttäytymiskertausten osalta (F(2.7) = 32.7, ). Tarkempi analyysi Tukeyn post hoc -testillä osoitti, että kontrolliryhmässä, MD:n annoksella 75 mg/kg ja MD:n annoksella 150 mg/kg esiintyi vähemmän perääntymisiä, kun ne altistettiin 3 tuntia myöhemmin uudelleen avoimelle kentälle. MD 300 mg/kg:n annoksella vähensi perääntymisten määrää, kun ryhmä altistettiin uudelleen 2 ja 3 tuntia myöhemmin avokentälle.
Avokentän keskelle suuntautuneiden käyntien analysoinnissa (kuva 1(c)) toistettujen mittausten varianssianalyysi osoitti merkittäviä eroja MD:n annostelun välillä (F(3.34) = 15.70, ). Tarkempi analyysi Tukeyn post hoc -testillä osoitti, että MD-annos 300 mg/kg lisäsi käyntejä avoimen kentän keskelle verrattuna kontrolliin 1 h annostelun jälkeen. Lisäksi MD lisäsi kaikilla annetuilla annoksilla käyntejä avoimen kentän keskellä 3 h antamisen jälkeen.
3.2. Biokemiallinen analyysi
Kuten kuvasta 2(a) käy ilmi, TBARS-tasot kasvoivat merkitsevästi amygdalassa (F(3) = 4.18, ), hippokampuksessa (F(3) = 44.9, ) ja striatumissa (F(3) = 7.07, ) rotilla, joita hoidettiin MD:llä annoksella 300 mg / kg kontrolliryhmään verrattuna.
(a)
(b)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(a)
(b)
.
Kuten kuvasta 2(b) voidaan havaita, MD:n antamisen jälkeen havaittiin merkitsevää karbonyylin muodostumisen lisääntymistä prefrontaalisessa aivokuoressa (F(3) = 29,9, ) annoksella 300 mg/kg ja amygdalassa (F(3) = 9,74, ) ja hippokampuksessa (F(3) = 17,99, ) annoksella 75 mg/kg. Sitä vastoin MD-hoito annoksilla 75 ja 300 mg/kg vähensi merkittävästi karbonyylin muodostumista striatumissa (F(3) = 21.93, ) verrattuna kontrolliryhmään.
4. Keskustelu
Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että MD:n yksittäinen injektio suurella annoksella (300 mg / kg) indusoi rotilla hyperlocomotionin, joka ei pysy 2 ja 3 tuntia antamisen jälkeen. Tulostemme mukaan MD lisäsi merkittävästi lokomotorista aktiivisuutta ja lisäsi striatumin solunulkoista dopamiinitasoa rhesusapinoilla . Young ja kollegat osoittivat, että MD lisäsi C57BL/6J- ja 129/SJ-hiirten aktiivisuutta, kasvatusta ja liikeratojen tasaisuutta. Nämä käyttäytymisen MD:n aiheuttamat muutokset liittyivät lisääntyneeseen synaptiseen dopamiiniin ja dopamiinin drd1- ja drd4-reseptorien välittämiin sekundaarisiin vaikutuksiin. Toisin kuin edellä mainitussa tutkimuksessa, vaikka suuntaus on olemassa, emme havaitse merkittävää kasvua eksploratiivisessa käyttäytymisessä MD-annostelun jälkeen. Tämä ristiriita voidaan selittää menetelmien, lajien ja hoitoaikojen eroilla.
Tässä havaitsimme, että kontrolliryhmä ja MD pieninä annoksina (75 ja 150 mg/kg) vähensivät ylitysten ja peräännyttämisten määrää, kun ne altistettiin uudelleen 3 tuntia myöhemmin avokentälle, mikä osoittaa tottumista ympäristöön. MD suurella annoksella (300 mg/kg) vähensi ylitysten ja perääntymisten määrää, kun se altistettiin uudelleen 2 ja 3 tuntia myöhemmin avokentälle. Tämä ristiriita voidaan selittää sillä, että 1 tunti MD:n (300 mg/kg) antamisen jälkeen ylitysten määrä lisääntyi merkittävästi ja pyrki lisäämään perääntymisten määrää. Totuttelun uuteen ympäristöön uskotaan olevan yksi ei-assosiatiivisen oppimisen alkeellisimmista muodoista. Toistuva altistuminen samalle ympäristölle aiheuttaa eksploratiivisen käyttäytymisen vähenemisen, jota voidaan pitää tottumisen indeksinä .
Tässä tutkimuksessa mielenkiintoinen havainto oli, että MD moduloi ahdistukseen liittyvää käyttäytymistä. Avoimen kentän testissä MD-käsitellyt rotat olivat vähemmän ahdistuneita ja jopa pyrkivät tutkimaan vastenmielistä keskusaluetta enemmän kuin kontrollit. MD:n annos 300 mg/kg lisäsi käyntien määrää avoimen kentän keskellä 1 h antamisen jälkeen. Lisäksi MD lisäsi kaikilla annetuilla annoksilla käyntejä avoimen kentän keskellä 3 tunnin kuluttua annostelusta. Kirjallisuudessa tutkimukset ovat ristiriitaisia MD:n vaikutuksesta ahdistuneisuuteen. Prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että modafiniilillä ei ole vaikutusta ahdistuneisuuteen tai että sillä on anksiolyyttinen vaikutus. Vastaavasti kliinisissä tutkimuksissa MD:llä on joko anksiolyyttinen vaikutus tai ei vaikutusta ahdistuneisuuteen , kun taas toiset osoittavat anksiogeenista vaikutusta . Tämä tutkimusten välinen ero voi selittyä käytettyjen annosten (100 mg, 200 mg tai 400 mg) ja annosteluohjelman vaihtelulla (kerta-annos vs. krooninen annos viikon tai useamman viikon aikana). MD:n anksiolyyttisen kaltaiset vaikutukset voidaan selittää sen vaikutuksilla amygdalaan, joka on ahdistukseen osallistuva aivoalue, uhkaaviin ärsykkeisiin. Aiempi tutkimus osoitti, että MD vähentää amygdalan reaktiivisuutta pelottaviin ärsykkeisiin . Tiedetään, että amygdalassa on runsaasti katekolaminergisiä ja serotoniinergisiä projektioita , jolloin MD todennäköisesti vähentää amygdalan reaktiivisuutta muuttamalla amygdalan sisäistä signalointia, joka johtuu noradrenaliini-, dopamiini-, serotoniini- tai GABA-järjestelmien muutoksista tai näiden vaikutusten yhdistelmästä.
Käyttäytymismuutosten aikaansaamisen lisäksi kirjallisuudessa on kuvattu hyvin, että psykostimulantit aiheuttavat oksidatiivisia vaurioita sekä eläinmalleissa että ihmisillä. Tuloksemme osoittavat, että MD lisää lipidien ja proteiinien oksidatiivisia vaurioita rottien aivoissa. TBARS-tasot kasvoivat MD:tä suurella annoksella (300 mg/kg) saaneiden rottien amygdalassa, hippokampuksessa ja striatumissa. Lisäksi havaittiin karbonyylin muodostumisen lisääntymistä MD:n antamisen jälkeen prefrontaalisessa aivokuoressa annoksella 300 mg/kg ja amygdalassa ja hippokampuksessa annoksella 75 mg/kg. Tutkimukset osoittavat, että MD estää dopamiinin kuljettajaa, mikä lisää dopaminergistä neurotransmissiota . MD:n aiheuttama solunulkoisen dopamiinipitoisuuden nousu voi aiheuttaa dopamiinin hapettumisen myrkyllisen aineenvaihduntatuotteen ylituotantoa , mikä johtaa rottien aivojen proteiinien ja lipidien hapettumisvaurioihin. Kirjallisuudessa ei ole tutkimuksia, joissa arvioitaisiin aivovaurioita MD:n antamisen jälkeen; nämä tutkimukset ovat kuitenkin erittäin tärkeitä, kun otetaan huomioon, että MD:n, kuten valppautta lisäävän, muistia parantavan ja väsymystä ehkäisevän lääkkeen, saatavuus terveille ihmisille lisääntyy .
Käänteisesti MD-hoito (75 ja 300 mg / kg) vähensi karbonyylin muodostumista striatumissa kontrolliryhmään verrattuna. Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet MD:n striatumin neuroprotektiivisen potentiaalin. Aiemmat tutkimukset osoittavat, että 1-metyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiinillä myrkytettyjen dopaminergisten neuronien eloonjääminen striatumissa parani MD-hoidon jälkeen Parkinsonin taudin eläinmallissa. Raineri ja kollegat ovat osoittaneet, että MD:n anto vaimensi metamfetamiinin aiheuttamaa neurotoksisuutta hiirten striatumissa, mikä viittaa MD:n mahdolliseen suojaavaan rooliin tällä aivoalueella. MD:n on osoitettu parantavan metamfetamiiniriippuvaisten potilaiden oppimista. Tässä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että MD:n antamisella saattaa olla antioksidanttisia ominaisuuksia striatumissa; MD:n suojaavaa vaikutusta striatumiin ei kuitenkaan vielä tunneta. Striatum integroi aivokuorelta ja talamuksesta tulevia glutamatergisia syötteitä keskiaivoista tulevien dopaminergisten afferenttien kanssa . Dopamiinisignaalien välityksellä on keskeinen rooli striatumin riippuvaisessa oppimisessa ja keskipitkän piikkihaarakkeen projektioneuronien synaptisessa plastisuudessa . Rossato ja kollegat osoittivat, että D1-reseptoriagonistin infuusio lisäsi aivoista peräisin olevan neurotrofisen tekijän (BDNF) tasoja ja siten synaptista plastisuutta. Siten MD voi edistää synaptista plastisuutta aktivoimalla dopaminergistä järjestelmää ja siten suojata striatumia hapettumisvaurioilta.
Johtopäätöksenä pystymme osoittamaan, että (1) MD aiheuttaa hyperaktiivisuutta suurella annoksella (300 mg / kg) 1 h annostelun jälkeen, joka ei pysy 2 ja 3 tuntia annostelun jälkeen. (2) MD osoitti anksiolyyttisiä vaikutuksia rotilla, mikä lisäsi käyntien määrää avoimen kentän keskelle. (3) MD aiheutti rotan aivoissa lipidien ja proteiinien oksidatiivisia vaurioita; oksidatiiviset vauriot riippuvat kuitenkin analysoidusta aivoalueesta ja annetusta MD-annoksesta. (4) Lopuksi MD saattoi suojata striatumia proteiinien oksidatiivisilta vaurioilta. Tulosten tulkinnassa on noudatettava varovaisuutta. Ensinnäkin antioksidanttipuolustusta ei mitattu; koska tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa tutkitaan MD:n vaikutusta oksidatiiviseen stressiin, myönnämme, että se olisi voinut auttaa tulosten tulkinnassa. Toiseksi MD annettiin kuitenkin terveille rotille; MD:n vaikutukset oksidatiivisiin vaurioihin mielenterveyden häiriöiden eläinmalleissa saattavat osoittaa erilaisia tuloksia.
Interressiristiriita
Tekijät ilmoittavat, että tämän artikkelin julkaisemiseen ei liity eturistiriitoja.
Kiitokset
Neurotieteiden laboratorio (Brasilia) on yksi kansallisen siirtolääketieteen instituutin (INCT-TM) keskuksista ja yksi Santa Catarinan sovelletun neurotieteen huippuosaamiskeskuksen (NENASC) jäsenistä. Tätä tutkimusta on tuettu CNPq:n, FAPESC:n, Instituto Cérebro e Menten ja UNESC:n myöntämillä apurahoilla. João Quevedo on CNPq:n tutkija, ja Roger B. Varela, Wilson R. Resende ja Amanda V. Steckert ovat CAPES-opiskelijoita; Samira S. Valvassori on CNPq:n opiskelija.