”Molekyyligeneettistä tekniikkaa, jota käytetään organismien geenien tai genomin suoraan manipulointiin, muuttamiseen tai muokkaamiseen fenotyyppien manipuloimiseksi, kutsutaan geenitekniikaksi.”

Vai toisin sanoen voimme sanoa:

”Geenitekniikka on tekniikka, jonka avulla organismin geneettistä koostumusta voidaan muuttaa.”

Tekniikka tunnetaan usein nimellä geneettinen manipulaatio, geneettinen muokkaus tai geneettinen muutos, laajasti ottaen se luokitellaan geenitekniikaksi.

Tässä tekniikassa rakennetaan rekombinantti-DNA, joka lisätään isännän genomiin vektorin avulla. Tai voimme poistaa joitakin mutanttisia sekvenssejä genomista. Ensimmäisen rekombinantti-DNA:n rakensi Paul Berg vuonna 1972.

Geenitekniikan avulla voidaan rakentaa geneettisesti muunnettuja organismeja, jotka ovat meille taloudellisesti hyvin tärkeitä.

Tekniikkaa käytetään parannettujen kasvilajien, terapeuttisten lääkkeiden tai proteiinien tuottamiseen, perinnöllisten geneettisten häiriöiden ehkäisyyn ja geneettisesti muunnetun organismin rakentamiseen.

Tässä artikkelissa käsittelemme pääpuheenaiheena geenitekniikkaa ja sen sovelluksia. Artikkelin sisältö on,

• Mitä on geenitekniikka
  • Määritelmä
  • Historia
  • Tyypit
  • Prosessi

.

• Geenitekniikan soveltaminen
• Geenitekniikan rajoitukset
• Johtopäätökset

Ihminen on jo pitkään manipuloinut monien eliöiden perintöainesta. Valikoivan jalostuksen ja risteytysten avulla olemme luoneet taloudellisesti tärkeitä kasvilajeja.

Geenitekniikan eli geenimanipulaatiotekniikan kehittämisen tarkoituksena on tuottaa meille hyödyllisiä organismeja tai fenotyyppejä. Geenitekniikoita käytetään,

• Geneettisesti muunnettujen kasvilajien rakentamiseen.
• Bioottista ja bioottista stressiä kestävät kasvilajit.
• Taloudellisesti tärkeät kasvilajit
• Kaupallisesti arvokas organismi
• Terapeuttisten lääkkeiden tuottamiseen
• Geneettisten poikkeavuuksien ehkäisyyn.

”Geenitekniikassa kaksi eri solun DNA:ta yhdistetään ja lisätään isännän genomiin vektorin avulla.” Geenimanipulaatiokokeiden tärkeät osat selitetään tässä.

Kohteena oleva geeni: DNA-sekvenssi, jonka haluamme lisätä kohdesoluihimme.

Vektori: Plasmidi-DNA:n kaltaisten vektoreiden avulla kiinnostuksen kohteena oleva geeni lisätään isännän genomiin. Vektorit ovat eräänlaisia välineitä, jotka siirtävät geneettistä materiaalia.

Kohdesolut: Kohdesolut ovat solupopulaatio, jonka genomia haluamme manipuloida tai muuttaa.

Määritelmiä:

”Tekniikkaa, jota käytetään mutanttigeenin lisäämiseksi tai poistamiseksi tai organismin genomin manipuloimiseksi, kutsutaan geenitekniikaksi.”

Geenitekniikan historia:

Termiä geenitekniikka käytti ensimmäisen kerran tieteiskirjailija, ei kukaan tiedemies. Vuonna 1951 Jack Williamson käytti termiä ”geenitekniikka” ensimmäisen kerran romaanissaan ”Lohikäärmeen saari”.

Pian tämän jälkeen Watson ja Crick löysivät DNA:n molekyylirakenteen, vaikka geneettiset kokeet olivat suosittuja jo Mendelin ajoista lähtien.

Ensimmäisen rekombinantti-DNA:n rakensi Paul Berg vuonna 1972. Samana vuonna Herbert Boyer ja Stanley Cohen tekivät geeninsiirtokokeita. Vuonna 1974 Rudolf Jaenisch oli luonut geneettisesti muunnettuja hiiriä, ensimmäisen kerran genetiikan historiassa.

Rudolfin menestyksen jälkeen vuonna 1976 kehitettiin geneettisesti muunnettu eli geenimuunneltu tupakkakasvilaji.

Tänä aikana (vuosina 1960-1990) löydettiin restriktiodigestio-, ligaatio- ja PCR:n kaltaisia tekniikoita, jotka siivittivät geenitekniikkaa.

Seuraava artikkeli:

Geenitekniikoiden tyyppi:

Rekombinantti-DNA- Rekombinantti-DNA-tekniikka on eräänlainen geenitekniikan tekniikka, jossa keinotekoinen DNA-molekyyli rakennetaan ligaamalla kaksi eri DNA:ta fysikaalisin menetelmin. Tätä varten kiinnostava geeni lisätään plasmidivektoriin ja sitä käytetään geeninsiirtokokeissa.

Geenin siirto – Geenin siirtotekniikkaa käytetään kiinnostavan geenin lisäämiseen isännän genomiin.

Elektroforeesit, solicitaatio ja virusvektorivälitteinen geeninsiirto, liposomivälitteinen geeninsiirto, transposonivälitteinen geeninsiirto ovat joitakin tähän käytettyjä menetelmiä.

Geenieditointi- Geenieditointitekniikkaa käytetään genomin muokkaamiseen, jossa ei-toivottu DNA-sekvenssi poistetaan tai isännän genomiin voidaan lisätä uusi geeni. CRISPR-CAS9, TALEN ja ZFN ovat joitakin tunnettuja geeninmuokkaustyökaluja, joita käytetään geeniterapiakokeissa.

Lue lisää: Mitä on geenieditointi ja CRISPR-CAS9?

Geenitekniikan prosessi:

Geenitekniikkaa käytetään moniin eri tarkoituksiin, joten meidän on ensin päätettävä kokeen tarkoitus. Koko geenitekniikan prosessi voidaan jakaa 5 laajempaan vaiheeseen:

• Kandidaattigeenin valinta ja eristäminen
• Plasmidin valinta ja rakentaminen
• Geenin transformaatio
• DNA:n insertointi isännän genomiin
• Insertin varmistaminen

Kandidaattigeenin valinta ja eristäminen:

Geenin on sisällettävä DNA-sekvenssi, jota haluamme tutkia, ja sitä varten geenillä on joitakin erityisiä ominaisuuksia. Ehdokasgeenillä tulisi olla korkea GC-pitoisuus ja vähemmän toistuvaa DNA-sekvenssiä.

Tämän lisäksi kiinnostava geeni ei saa olla liian pitkä- vain muutaman kb:n geenit voidaan onnistuneesti lisätä. Mitä pidempi geeni on, sitä suurempi on epäonnistumisen mahdollisuus. Ehdokasgeenissä on oltava aloitus- ja lopetuskodoni. Aiheeseen liittyvä artikkeli: Mikä on geneettinen koodi?

Nyt kiinnostava geeni voidaan eristää muusta DNA:sta joko restriktiodigestiolla tai polymeraasiketjureaktiolla.

Rajoitusendonukleaasit ovat bakteerientsyymiä, joilla on kyky pilkkoa DNA-sekvenssi tietyssä kohdassa. Käyttämällä tietynlaista restriktioendonukleaasia voimme leikata ja eristää kiinnostavan geenimme.

Rajoitusdigestiomenetelmä on selitetty edellisessä artikkelissamme: Mikä on restriktiodigestio?

Polymeraasiketjureaktiossa kiinnostava geeni tai kandidaattigeeni monistetaan termosyklerissä geenisekvenssin tietojen avulla.

Kone tekee polymeraasiketjureaktiota käyttäen miljoonia kopioita meitä kiinnostavasta geenistä. Agaroosigeelielektroforeesin avulla monistettu geeni eristetään.

Jos kiinnostava geeni on tutkittu hyvin, aiemmin, geenin informaatio on saatavilla geenikirjastossa ja voimme käyttää sitä kiinnostavan geenin keinotekoiseen synteesiin. (geenikirjaston informaation avulla geeni voidaan myös syntetisoida keinotekoisesti)

Seuraavassa vaiheessa suoritetaan tarvittaessa DNA-puhdistus. Nyt DNA:mme on valmis lisättäväksi plasmidiin.

Plasmidin valinta ja rakentaminen:

Plasmidin valitseminen geenitekniikkakokeeseen on yksi koko kokeen ratkaisevista vaiheista. Ennen plasmidin valintaa on ymmärrettävä, miksi plasmidia käytetään geeninsiirtokokeissa.

Plasmidi-DNA on bakteerien sytoplasman pyöreää, kaksijuosteista DNA:ta, joka monistuu itsenäisesti.

Tutkijat käyttävät sitä välineenä, jolla kiinnostava geeni siirretään kohdekohtaan genomissa. Se pystyy siirtämään geenin tehokkaasti kohdepaikkaan. Plasmidin rakenne on selitetty alla olevassa kuvassa,

Seuraava artikkeli: Mikä on plasmidi?

Plasmidin valmistus:

Valitse kokeeseesi sopiva plasmidi.

Plasmidissa on oltava replikaation alkuperä, promoottorialue, antibioottiresistenssigeeni ja muita tärkeitä sekvenssejä. Restriktiodigestiomenetelmää käyttäen plasmidiin tuodaan insertiokohta, johon kiinnostava geenimme ligitoidaan.

Käyttämällä T4-DNA-ligaasia, kuten power sealeria, kiinnostava DNA lisätään ja ligoidaan plasmidiin. Yhdessä plasmidin kanssa plasmidi-DNA:han lisätään myös selektiivinen merkkiaine rekombinantti-DNA:n tunnistamiseksi.

Tämän lisäksi plasmidiin sisällytetään myös promoottori- ja terminaattorisekvenssit kiinnostavan geenin tehokasta ilmentymistä varten. Plasmidia, jossa on haluamamme geeni ja joitakin muita tärkeitä sekvenssejä, kutsutaan nyt rekombinantti-DNA-molekyyliksi.

Nyt rekombinantti-DNA:mme on valmis ekspressiota varten.

Jos suoritamme geenin kloonausta, plasmidi asetetaan bakteeri-isäntäkasvattamoon, ja tähän käytetään yleensä E.Coli-bakteeria. Kun bakteeri alkaa jakautua, myös rekombinanttiplasmidi-DNA monistuu sen mukana.

Nyt meillä on useita kopioita plasmidi-DNA:sta, jotka uutetaan plasmidi-DNA:n uuttosarjalla ja käytetään muunnoskokeisiin.

Transformaatio isännän genomiin:

Rekombinantti-DNA:n siirtäminen vastaanottajasoluun tai isäntägenomiin on jälleen yksi työläs ja vaikea tehtävä. Erilaisia menetelmiä rekombinantti-DNA:n lisäämiseen käytetään eri solutyypeille, koska yhtä menetelmää ei voida käyttää kaikille solutyypeille.

Erilaisia menetelmiä transformaatioon:

Käyttämällä stressiä- bakteerit omaksuvat helposti plasmidi-DNA:n käyttämällä joitakin stressitekijöitä, kuten lämpöä tai sähkösukkaa.

Mikroinjektio- DNA:n lisäämiseen suoraan solun ytimeen käytetään terävää neulaa, mutta menetelmä on kuitenkin vähemmän tehokas ja vaatii korkeampaa asiantuntemusta.

Elektroporaatio- yksi parhaista menetelmistä, jolla on suuri onnistumisprosentti, on elektroforaatiomenetelmä, jossa rekombinantti-DNA lisätään isännän genomiin permeabiloimalla solu sähkövirralla.

Olemme käsitelleet sitä koko artikkelin verran. Lue se täältä: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonication- sonication- sonication on vielä toinen hyvä menetelmä, jota käytetään joskus geeninsiirtokokeessa, jossa rekombinantti-DNA lisätään kohdesoluun ultraääniaaltojen avulla. Ultraääniaallot lisäävät myös solujen läpäisevyyttä.

Liposomivälitteinen geeninsiirto – Käyttämällä keinotekoista solun kaltaista ulkokuorta, joka tunnetaan nimellä liposomi – rekombinantti-DNA voidaan lisätä isännän genomiin.

Geeninsiirto bakteeri-infektion avulla- Tämä menetelmä on yksi suosituimmista menetelmistä ja sitä käytetään rutiininomaisesti kasvien geenitekniikkakokeissa. Tässä kasvilaji infektoidaan transformoidulla bakteerilla kiinnostavan geenin lisäämiseksi.

Agrobacterium tumifeciania käytetään yhdistelmä-DNA:n lisäämiseksi kasvisoluun. Kiinnostava geeni lisätään Agrobacteriumin Ti- plasmidiin. Kasvisolut infektoidaan tällä bakteerisoluviljelmällä ja muunnetut solut regeneroidaan kasvien kudosviljelymenetelmiä käyttäen.

Kemialliset geeninsiirrossa- Geeninsiirtokokeissa käytetään myös joitakin metalli-ioneja, kemikaaleja ja eri kemikaalien liuoksia, mutta onnistumisprosentti on kuitenkin liian alhainen muihin menetelmiin verrattuna.

Insertin vahvistaminen:

Työmme on vielä kesken.

Nyt meidän on konformoitava, onko rekombinantti-DNA inseroitunut kohdesoluumme vai ei. Siihen käytetään erilaisia molekyyligeneettisiä tekniikoita. Perinteisessä viljelymenetelmässä käytetään selektiivisen merkkiaineen läsnäoloa tai puuttumista erottamaan muunnetut solut muuntumattomista soluista.

Vaikka se ei ole välttämätöntä PCR-pohjaisessa osoitusmenetelmässä. Polymeraasiketjureaktioon perustuva osoitusmenetelmä on laajalti hyväksytty luotettavampi kuin muut menetelmät.

DNA uutetaan transformoidusta solusta ja monistetaan käyttämällä alukkeita, jotka ovat komplementaarisia kiinnostavalle geenillemme tai rekombinantti-DNA:llemme.

Jos rekombinantti-DNA:ta esiintyy, se monistetaan varmasti, muuten ei saada monistusta. Kahden tekijän konformaatiota varten otetaan yksi alukesarja, joka on komplementaarinen rekombinantti-DNA:lle spesifiselle ja yksi alukesarja, joka on komplementaarinen valikoivalle markkerisekvenssille, ja suoritetaan multipleksi-PCR.

Tulosten validoimiseksi molemmissa reaktioissa on saatava aikaan amplifikaatio.

Mutta hetkinen!

Mitä tapahtuu, jos kiinnostuksen kohteena olevassa geenissämme tapahtuu kokeen aikana mutaatio? Koska PCR voi vain monistaa DNA:ta. Meidän täytyy tarvita sekvenssitietoa mutaation havaitsemiseksi.

Sitä varten käytetään DNA:n sekvensointimenetelmää.

Transformoiduista soluista uutetaan DNA ja kiinnostava geeni monistetaan PCR:llä. Nyt PCR-amplikoneista tehdään DNA-sekvensointi, jossa fluoresoivaa kemiaa käyttäen määritetään järjestyksessä kiinnostavan geenimme sekvenssi.

Kun kaikki parametrit kiinnostavan geenin määrittämiseksi ovat täyttyneet, solumme ovat nyt valmiita injektoitaviksi isäntäorganismiin tai kudosviljelykokeisiin.

Geenitekniikan sovellukset:

Pääsemme nyt tämän aiheen tärkeimpään kohtaan: ”Mihin geenitekniikkaa käytetään?”

Geenitekniikalla on suuri teollinen ja maataloudellinen arvo. Sitä harjoitetaan lääketieteessä, geenitutkimuksessa, maataloudessa, viljelykasvien parantamisessa ja terapeuttisten lääkkeiden tuotannossa.

Sitä käytetään myös geneettisesti muunnettujen organismien kehittämisessä. Tässä keskustelemme joistakin geenitekniikan tärkeistä sovelluksista.

Rekombinantti-DNA-tekniikkaa käytetään viljelykasvien parantamisessa ja uusien taloudellisesti tärkeiden ominaisuuksien kehittämisessä. Joitakin niistä ovat mm:

• Herbisidiresistenssi
• Virusresistenssi
• hedelmien viivästynyt kypsyminen
• muutettu öljypitoisuus
• siitepölynhallinta
• kylmää ja kuivuutta sietävien kasvilajien kehittäminen.

Klassinen esimerkki siitä on BT-puuvilla- yksi geneettisesti muunnettujen lajien tyyppi antaa kasville resistenssin bacillus thuringiensis -bakteeria vastaan.

Geneettisesti muunnettujen kasvilajien kehittämisprosessi:

Kiinnostava geeni eristetään organismista restriktiodigestiolla tai monistetaan polymeraasiketjureaktiolla. Rekombinantti-DNA rakennetaan insertoimalla kiinnostava geeni plasmidiin, tässä käytetään T-plasmidia.

Seuraavassa vaiheessa T- plasmidi lisätään agrobakteeriin. Viimeisessä vaiheessa kasvilaji infektoidaan transformoiduilla bakteerisoluilla ja viljellään. Koko prosessi on esitetty alla olevassa kuvassa

GMF- geneettisesti muunnetut elintarvikkeet on toinen geenitekniikan paras sovellus, jossa taloudellisesti tärkeitä elintarvikkeita rakennetaan rekombinantti-DNA-tekniikan avulla.

Klassinen esimerkki siitä on Flavr Savr -tomaatti, geneettisesti muunnettu tomaattilaji, joka on valmistettu antisense RNA -tekniikalla. Sillä on suuria taloudellisia arvoja, koska GM-tomaattia voidaan helposti kuljettaa paikasta toiseen.

Toinen tärkeä geenitekniikan sovellus on geneettisesti muunnettu tai geenitekniikalla muunnettu elintarvike.

Joidenkin elintarvikkeiden, kuten puuvillan, maissin ja soijapavun, laatua parannetaan nykyisellä rekombinantti-DNA-tekniikalla. Geneettisesti muunnettujen viljelykasvien tai kasvilajien kehittämisen tavoitteena on tehdä niistä taloudellisesti tärkeitä, ravitsevia, proteiinipitoisia, sairauksia ja stressiä kestäviä.

Jopa geenitekniikan ja kudosviljelytekniikoiden avulla kehitetään hyönteismyrkkyjä kestäviä kasvilajeja tupakkaan, perunaan, maissiin ja puuvillaan.

Tämän lisäksi nykyisellä geenimuuntelutekniikalla voidaan luoda myös joitakin muunnettuja kasveja, jotka kykenevät tuottamaan omia lannoitteitaan.

Transgeenisiä malliorganismeja kehitetään erilaisten parametrien testaamiseksi- tiettyjen geenien toiminta voidaan määrittää suunnittelemalla transgeenisiä mikro-organismi- ja eläinmalleja.

Haitalliset taudinaiheuttajat ja hyönteismyrkyt voidaan tuhota käyttämällä muuntogeenisiä mikro-organismeja, jotka kykenevät hajottamaan myrkkyjä.

Lääketieteelliset sovellukset:

Taloudellisia lääkkeitä, hormoneja, entsyymejä ja rokotteita luodaan geenitekniikan välineillä.

Veren hyytymistä estävä tekijä on siitä paras esimerkki, jossa verihyytymän liuottamiseen kykenevä plasminogeeniä aktivoiva entsyymi suunnitellaan keinotekoisesti ja sitä käytetään sepelvaltimotauti- tai sydänkohtauspotilailla.

Muita esimerkkejä ovat kaksi muuta terapeuttista proteiinia somatostatiini ja lymfokiinit, jotka toimivat useita tautitiloja vastaan ja joita voidaan syntetisoida keinotekoisesti. Insuliini on vielä klassinen esimerkki geenitekniikan avulla suunnitellusta terapeuttisesta proteiinista.

Insuliinin geeni eristetään restriktiodigestiolla tai PCR:n avulla ja lisätään plasmidiin. Rekombinanttiplasmidi-DNA lisätään välittömästi bakteeri- tai hiivasoluun, jossa plasmidi lisääntyy. Kun mikro-organismi alkaa jakautua, se alkaa valmistaa keinotekoista insuliinia.

Suuri määrä insuliinia tuotetaan samalla tekniikalla teollisessa mittakaavassa. Insuliinin valmistuksen yksityiskohtainen hahmotelma on esitetty alla olevassa kuvassa,

Insuliinin kaupallinen tuotanto alkoi FDA:n hyväksynnän jälkeen vuonna 1982.

Rekombinanttirokotteet:

Rokotteita isorokkoa, herpes simplex -virusta ja hepatiittia vastaan tuotetaan geenitekniikan avulla. Rokotteet ovat inaktivoituja virushiukkasia, joita käytetään aiheuttamaan immuunivaste kyseistä taudinaiheuttajaa vastaan, mutta kontaminaation mahdollisuus on siinä suuri.

Käyttämällä rekombinantti-DNA-tekniikkaa tutkijat ovat luoneet ainutlaatuisen rokotetyypin, joka sisältää vain viruksen päällysproteiinin DNA:n, jolloin taudinaiheuttaja ei voi koskaan enää aktivoitua. Sen tärkein etu on, että se on turvallisempi, kontaminaatiovapaa ja reaktiivisempi.

Geenitekniikka geeniterapiassa:

Geeniterapian tai geeninsiirtotekniikan avulla voidaan parantaa perinnöllisiä geneettisiä häiriöitä. Kystisen fibroosin, Duchennen lihasdystrofian ja sirppisoluanemian kaltaiset geeniterapiat ovat nyt viimeisessä kliinisessä koevaiheessa ja valmiita käytettäväksi potilailla.

Geeniterapiassa viallinen, toimimaton tai mutatoitunut geeni korvataan villin tyypin geenillä käyttäen samaa tekniikkaa kuin edellä on selitetty.

Olemme käsitelleet hämmästyttäviä artikkeleita geeniterapiasta, lue se täältä:

1. Geeniterapia:
2. Mitä on geeniterapia ja miten se toimii?
3. Naked DNA Mediated Gene Therapy
4. Sleeping Beauty Transposon System: Geeniterapian tulevaisuus

Tämän lisäksi geenitekniikkaa käytetään niin ikään biopolttoaineiden, tautien, bioalkoholin ja muiden välttämättömien tuotteiden tuotannossa.

Geenitekniikan rajoitukset:

Geeniterapian ja geenitekniikalla valmistettujen tuotteiden käyttöön liittyy eettisiä kysymyksiä.

Toisaalta, jotta elintarvikkeelle tai mille tahansa muuntogeeniselle tuotteelle saataisiin taloudellista arvoa, ravintoarvot vaarantuvat.

Haittojen vuoksi uusia vastustuskykyisiä patogeenikantoja kehittyy nopeammin.

Myös geeniterapian sivuvaikutukset ja virusten käyttö siinä ovat haitallisia kohdeorganismille.

Tekniikka on kalliimpaa, sillä geeniterapia maksaa jopa 50 000 dollaria.

Johtopäätös:

Alkiolla tai sikiöllä leikkiminen on luonnonlain vastaista, ihmiset uskovat siihen vahvasti, joten geneettisesti muunnetuista elintarvikkeista ja kasvituotteista tulee aina kiistojen keskipiste.

Mutta geenitekniikan välineitä, kuten geeniterapiaa ja geeninsiirtotekniikkaa, käyttämällä voidaan ehkäistä perinnöllisiä sairauksia ja syövän kaltaisia tappavia sairauksia. Geenitekniikoiden myönteinen käyttö voi muuttaa ihmiskunnan kohtaloa.

Lähteet:

1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Geneettisesti muunnettujen elintarvikkeiden turvallisuus: Approaches to Assessing Unintended Health Effects. Washington (DC): National Academies Press (Yhdysvallat); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. Geenimanipulaation periaatteet. Johdatus geenitekniikkaan. Studies in microbiology. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.