Knockout-hiirten tuottaminen

Knockout-hiirten tuottamiseen käytettäviä tekniikoita ovat homologinen rekombinaatio (tai geenien kohdentaminen) ja geenien ansastaminen. Molemmissa menetelmissä käytetään hiiren alkion kantasoluja (ES-soluja), jotka eristetään hiiren alkioista noin neljän päivän kuluttua hedelmöityksestä. Ensimmäisessä lähestymistavassa, homologisessa rekombinaatiossa, hiiren ES-solun ytimeen tuodaan keinotekoista DNA:ta, jonka rinnakkaiset sekvenssit ovat homologisia (identtisiä) kohdegeenin DNA-sekvenssin ylä- ja alapuolella olevien sekvenssien kanssa. ES-solu tunnistaa homologiset vierekkäiset sekvenssit ja vaihtaa olemassa olevan kohdegeenin DNA:n vieraan DNA:n osiin. Vieras DNA on kuitenkin inaktiivinen. Näin ollen sen sisällyttäminen ES-solun genomiin inaktivoi tai tyrmää kohdegeenin. Vieras DNA on tyypillisesti suunniteltu kantamaan reportterigeeniä, joka merkitsee olemassa olevan geenin sijainnin, jolloin tutkijat voivat seurata sen läsnäoloa hiirisolujen genomissa, kun solut monistuvat. Homologinen rekombinaatio on valittu menetelmä silloin, kun vaaditaan, että tietty alleeli (geeni) on korvattava muunnetulla DNA-sekvenssillä ilman, että se vaikuttaa muihin geeneihin genomissa.

Geenin vangitsemisessa käytetään myös keinotekoista DNA:ta, joka kantaa reportterigeeniä. Sen sijaan, että kohdistettaisiin tiettyyn geeniin, vieras DNA kuitenkin liitetään satunnaisesti mihin tahansa geeniin hiiren ES-solujen genomissa. Vieras sekvenssi estää häiriintynyttä geeniä koodaamasta proteiinituotteitaan, mikä tekee geenistä inaktiivisen. Kun reportterigeeni aktivoituu sen jälkeen, kun se on sisällytetty ES-solujen genomiin, tutkijat voivat seurata geenin aktiivisuutta ja päätellä häiriintyneen geenin toimintaa.

Keinotekoiset DNA-sekvenssit siirretään tyypillisesti hiiren ES-soluihin retroviruksen tai muun virusvektorin avulla, minkä jälkeen muunnettuja ES-soluja kasvatetaan soluviljelmissä. Muutaman päivän kuluttua solut ruiskutetaan varhaisiin hiiren alkioihin, jotka sen jälkeen istutetaan sijaissynnyttäjän kohtuun, jossa ne lopulta kehittyvät ja kantavat tiineyden. Näin syntyneet hiirenpennut sisältävät sekä muunneltua että ei-muunneltua kudosta, joten ne eivät ole täydellisiä knockout-hiiriä. Jotta saadaan aikaan pari todellisia tyrmäyshiiriä (homologisia tyrmäyshiiriä), hiiret on jalostettava useiden sukupolvien ajan. Aluksi eläimet risteytetään muiden hiirten kanssa, jotta saadaan heterotsygoottisia yksilöitä (hiiriä, joilla on yksi kopio kohdegeenistä); heterotsygoottiset eläimet risteytetään sitten keskenään, jotta saadaan homotsygoottisia yksilöitä.