Improvement of Sperm Quality in Hyperviscous Semen following DNase I Treatment
Abstract
Semen hyperviskositeetti heikentää siittiöiden liikkuvuutta ja voi johtaa miesten hedelmättömyyteen. Tässä prospektiivisessa tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan eksogeenisen DNaasin kykyä parantaa sperman laatua ottaen huomioon, että DNaasia on löydetty useiden lajien siemenplasmasta ja että neutrofiilit vapauttavat kromatiinia vangitakseen bakteereja. Tässä analyysissä verrattiin yhteensä seitsemääkymmentäseitsemää siemennestenäytettä, joilla oli korkea siemennesteen viskositeetti (HSV) tutkimusryhmänä, ja kuusikymmentäkaksi siemennestenäytettä, joilla oli normaali siemennesteen viskositeetti (NSV) kontrolliryhmänä. Nämä siemennestenäytteet jaettiin kolmeen ryhmään, jotka käsiteltiin (a) DNaasi I:llä 37 °C:ssa 15 minuutin ajan, (b) tiheysgradienttisentrifugoinnilla ja (c) edellä mainittujen kahden menetelmän yhdistelmällä. Hyperviskoosin siemennesteen viisitoista minuuttia kestäneen käsittelyn jälkeen siittiöiden liikkuvuus lisääntyi tilastollisesti merkitsevästi 83 prosentissa siemennestenäytteistä. Sitä vastoin normaalin viskositeetin omaavan siemennesteen DNaasikäsittelyllä ei ollut tällaisia vaikutuksia. Edellä mainittuun käsittelyyn liittyi myös normaalien siittiöiden prosenttiosuuden merkittävä kasvu, mikä johti teratozoosospermiaindeksin merkittävään laskuun. DNaasi I -käsittelyn jälkeen tiheysgradienttisentrifugoinnin läpikäyneiden siemennestenäytteiden ja pelkän tiheysgradienttikäsittelyn jälkeen kerättyjen siemennestenäytteiden vertailu osoitti, että ensin mainitussa tapauksessa tulokset olivat näyttävämpiä. Kummankin valmisteen arvioinnissa saannon suhteen (% progressiivisesti liikkuvien siittiöiden kokonaismäärästä käsittelyn jälkeen suhteessa alkuperäiseen siittiöiden kokonaismäärään) kävi ilmi, että yhdistetty lähestymistapa johti 29,8 %:iin verrattuna 18,5 %:iin pelkällä tiheysgradienttikäsittelyllä (p=0,0121). DNaasi I -hoito johtaa siittiöiden liikkuvuuden ja morfologian paranemiseen, ja siitä voisi olla hyötyä miehille, joilla on hyperviskoosia siemennestettä, avusteisen lisääntymisen pöytäkirjoissa.
1. Johdanto
Tutkimuksissa on dokumentoitu, että siemennesteen hyperviskositeettia (SHV) esiintyy 12-29 %:ssa ejakulaateista . SHV on tila, joka voi johtaa miehen hedelmättömyyteen , koska se voi vakavasti heikentää siemennesteen fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia . Se on yhdistetty siittiöiden heikentyneeseen liikkuvuuteen sekä huonoon tulokseen koeputkihedelmöityksessä ja lisääntyneeseen reaktiivisten happilaatujen (ROS) tuotantoon. Lisäksi siemennesteen oksidatiivisten vaurioiden tuotetasot ovat korreloineet merkitsevästi siemennesteen viskositeetin kanssa hedelmättömillä miehillä .
On olemassa vahvoja viitteitä sellaisten inhibitoristen reittien olemassaolosta, jotka heikentävät siittiöiden laatua tuottamalla ROS:ia siittiöiden kulkiessa miehen sukupuolielinten läpi , viitteitä siittiöiden vaurioitumisesta laboratoriokäsittelyn ja -säilytyksen aikana , mutta myös viitteitä ROS:ien ylimääräisestä tuotannosta ”itsestään” siemensyöksyn jälkeen ainakin joissakin siemennesteen ylikylläisyydestä johtuvissa tapauksissa . Tämä tila liittyy useimmiten miehen lisäsukupuolirauhasen infektioon ja varikoeleen , vaikka patofysiologiaa ei vieläkään täysin ymmärretä. Lisäksi siemennesteen antioksidanttikapasiteetti on heikentynyt oligoasthenozoosospermianäytteissä siemennesteen hyperviskositeettitapauksissa . Lisäksi liialliset ROS-pitoisuudet aiheuttavat lipidiperoksidaatiota, joka häiritsee kalvojen morfologiaa . Lisääntynyt leukosyyttien määrä siemennesteessä liittyy SHV:hen . Lisäksi leukosyytit ovat merkittävä ROS:ien ja retrovirusten vektoreiden lähde siemennesteessä, ja niiden esiintyminen on yhdistetty hedelmöitystodennäköisyyden pienenemiseen sekä kohdunsisäisen keinosiemennyksen ja perinteisen IVF:n heikompaan onnistumisprosenttiin . Lisäksi SHV korreloi siemennesteen mikrobiston koostumuksen ja patogeenisten bakteerien suuremman esiintyvyyden kanssa .
Moneita terapeuttisia lähestymistapoja on ehdotettu SHV-siemennesteen viskositeetin vähentämiseksi. Ylikastelu ja eturauhashieronta eivät olleet tehokkaita . Siemennesteen hellävarainen aspirointi ja karkottaminen 5 ml:n ruiskun kautta ovat lähes tehottomia, koska SHV ei ole mekaaninen ilmiö . Proteolyysi kymotrypsiinin avulla parantaa hyperviskoosin siemennesteen käsittelyä, vaikka siittiöiden proteiineissa tapahtuu joitakin muutoksia . Ottaen huomioon, että tällainen menettely voi vahingoittaa siittiöiden rakennetta ja että useimmissa tapauksissa SHV korreloi leukosytospermian kanssa , oletimme, että SHV:n aiheuttavat neutrofiilien solunulkoiset ansat (NET) ja että ne ovat herkkiä DNA:n hajottamiselle DNaasi I:n avulla. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen raportti DNaasi I:n käytöstä SHV:n käsittelemiseksi.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1. Materiaalit ja menetelmät. Osallistujat
Prospektiivinen tutkimus suoritettiin kolmen vuoden ajan potilailla, joilla oli aiemmin ollut hedelmättömyyttä Ateenan lääketieteellisessä klinikassa, Locus Medicus, seuraavilla poissulkukriteereillä: varikocesele hypogonadismi, kryptorchidismi ja siemennesteen synnynnäinen tukos. Tutkimusryhmäksi saatiin seitsemänkymmentäseitsemän siemennestenäytettä, joissa oli HSV, ja kontrolliryhmäksi saatiin kuusikymmentäkaksi siemennestenäytettä, joissa ei ollut NSV:tä. Aluksi kolmekymmentäkaksi HSV:tä sisältävää siemennestenäytettä ja kymmenen NSV:tä sisältävää siemennestenäytettä käsiteltiin DNaasi I:llä. Lisäksi toinen kaksikymmentäkuusi HSV:tä sisältävää siemennestenäytettä ja 52 NSV:tä sisältävää siemennestenäytettä käsiteltiin tiheysgradienttisentrifugointimenetelmällä. Lopuksi yhdeksäntoista HSV-näytettä käsiteltiin menetelmien yhdistelmällä eli käsittelemällä ne ensin DNaasi I:llä ja sitten DGC:llä. Kaikki osallistujat allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuslomakkeen ennen osallistumista.
2.2. Siemennesteanalyysi
Siemennestenäytteet, jotka saatiin masturbaatiolla 3-5 päivän seksuaalisen pidättäytymisen jälkeen, asetettiin steriileihin astioihin. Keräyksen jälkeen siemennäytteiden annettiin nesteytyä 37 °C:ssa, minkä jälkeen niille tehtiin tavanomainen analyysi siemennesteen analyysin vertailurajat ennen ja jälkeen edellä kuvatun yhdistelmäprosessin]. Motiliteetin arvioi sama virallisesti koulutettu (ESHRE) biologi, joka ei osallistu tutkimukseen. Valkosolujen (WBC) esiintyminen arvioitiin peroksidaasitestillä (Leukoscreen FertiPro; Belgia) WHO:n vuoden 2010 ohjeiden mukaisesti. Vaikka viskositeetti voitiin arvioida kvantitatiivisella viskosimetrillä , siemennesteen viskoelastisuus arvioitiin käyttämällä muovisia kertakäyttöpipettejä, jotka antoivat siemennesteen pudota painovoiman vaikutuksesta, ja tarkkailemalla mahdollisen kierteen pituutta. Miehet, joiden siemennesteen säikeen pituus oli 2 cm – 4 cm, luokiteltiin lievään SHV:hen (53,12 %); säikeen pituus 4 cm – 6 cm (40,62 %) luokiteltiin kohtalaiseksi SHV:ksi; ja säikeen pituus yli 6 cm diagnosoitiin vaikeaksi SHV:ksi (6,25 %), sisällytettiin korkean viskositeettiryhmään (HV), kun taas viskoelastisuus katsottiin normaaliksi säikeen pituuden ollessa 2 cm:n pituisena tai sitä lyhyempänä .
2.3 . Käsittely entsyymillä
DNaasi I:n vaikutus arvioitiin normaaleissa ja korkean viskositeetin siemennäytteissä. Nesteytyksen jälkeen DNaasi I:tä vedettiin varovasti steriiliin astiaan siemennestenäytteen kanssa 20 U/ml:n loppupitoisuuteen ja sekoitettiin jatkuvasti, minkä jälkeen sitä inkuboitiin 37 °C:ssa 15-60 minuuttia. Edellä mainittujen siemennestenäytteiden liikkuvuus ja morfologia analysoitiin ennen entsymaattista pilkkomista ja sen jälkeen, ja PR-% (liikkuvuus (a+b) % siittiöiden kokonaismäärästä) siittiöiden osuus ennen käsittelyä arvioitiin (eli alkuperäinen PR-%). Siemennesteen valmistelu
Tiheysgradienttisentrifugointimenetelmä (DGC) tehtiin valmistajan suositusten mukaisesti. Tiheysgradientti valmistetaan kerrostamalla 1 ml 40-prosenttista elatusainetta 80-prosenttisen elatusaineen PureSperm® (Nidacon International, Göteborg, Ruotsi) päälle 15 ml:n kartiomaisessa sentrifugiputkessa. Siemenneste kerrostettiin gradientin päälle ja sentrifugoitiin 300 g:ssa 20 minuuttia. Sentrifugoinnin laajuutta ja voimakkuutta voidaan vaihdella näytteen laadun mukaan: esimerkiksi pyöritysaikaa voidaan lisätä näytteille, joiden viskositeetti on korkea. Sentrifugoinnin jälkeen suurin osa supernatantista on poistettava varovasti ja pelletti on asetettava uuteen, puhtaaseen putkeen ja suspendoitava uudelleen hyvin 5 ml:aan väliaineeseen tiheysgradientin väliaineen poistamiseksi. Sen jälkeen sitä pyöritetään 200 g:n kierrosluvulla 10 minuutin ajan, supernatantti poistetaan ja lopullinen pelletti suspendoidaan uudelleen steriiliin elatusaineeseen avustettua lisääntymisteknologiaa (ART) varten. Lopuksi yhdistelmäkäsittelyssä näytteet, joilla oli korkea viskositeetti, käsiteltiin ensin DNaasi I:llä ja valmistettiin sitten edellä kuvatulla DGC-menetelmällä. Konsentraatio, motiliteetti ja morfologia määritettiin ennen valmistusta ja sen jälkeen.
Ottaen huomioon, että pesun jälkeinen progressiivisesti liikkuvien siittiöiden kokonaismäärä (Total Progressively Motile Sperm Count, TPMSC) voisi olla käyttökelpoinen ennustettaessa kohdunsisäisen keinosiemennyksen tehokkuutta, arvioitiin myös kunkin menetelmän tuottoa seuraavasti: TPMSC:n prosentuaalinen osuus sen jälkeen, kun näytteet oli käsitelty joko DGC-valmisteella tai DNaasi I:llä tai yhdistetyllä DNaasi I:llä käsittelyllä, jota seurasi DGC-valmiste, jaettiin ennen käsittelyä saatujen siittiöiden kokonaismäärällä. Lisäksi saantotulosta (eli lopullisen PR:n prosenttiosuutta / siittiöiden kokonaismäärä ennen käsittelyä) verrattiin alkuperäisen PR:n prosenttiosuuteen / siittiöiden kokonaismäärä ennen käsittelyä. Saanto arvioitiin siemennäytteistä, joiden viskositeetti oli joko korkea tai normaali. Vaikka ART:ssä annettujen liikkuvien siittiöiden määrästä ei vallitse yksimielisyyttä, yleisesti hyväksytään, että kunkin siemennestenäytteen liikkuvien siittiöiden enimmäismäärän talteenotto minkä tahansa hoidon jälkeen on erittäin tärkeää.
2.5. Tilastollinen analyysi
Tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA:lla, jota seurasi Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailutesti käyttäen GraphPad Prism 6.0 -ohjelmaa. Tilastollisesti merkitsevänä pidettiin p-arvoa, joka oli alle 0,05.
3. Tulokset
Valkosolujen (WBC) pitoisuus on esitetty kuvassa 1. Kaikkien ryhmien välillä on tilastollisesti merkitsevä ero (p=0,0238 yksisuuntainen ANOVA). Lisäksi tilastollinen ero HV-ryhmän sisällä on 0,0018.
WBC:n pitoisuus (106/ml) viskositeetin säikeen pituuden (lievä, kohtalainen ja vakava) mukaan HV-ryhmänä; w/o-v: siemenneste ilman viskositeettia.
DNAASI I:n käyttö lisää siittiöiden liikkuvuutta miehillä (32 koehenkilöä), joilla on korkea viskositeetti. Kuten kuvasta 2(a) käy ilmi, entsyymin lisääminen viidentoista minuutin ajaksi (t=15) parantaa (a) liikkuvuusprosenttia 2,875 prosentista siittiöitä 8,094 prosenttiin siittiöistä heti nesteytyksen jälkeen (t=0), mikä on tilastollisesti merkitsevää (p=0,049, moninkertaisen vertailun testi). Lisäksi PR-liike samojen aikapisteiden välillä nousi 27,468 prosentista tilastollisesti merkitsevään 46,59 prosenttiin (p<0,0001, moninkertainen vertailutesti). Samaan aikaan (c)-fraktion liikkuvuus laski 34,687 %:sta (t=0) 21,5 %:iin (t=15) (p<0,0001, moninkertainen vertailutesti), kun taas (d)-fraktion liikkuvuus laski 37,812 %:sta (t=0) 31,968 %:iin (t=15) (moninkertainen vertailutesti p=0,45). DNaasi I:n käyttö siemennesteessä, jonka viskositeetti on normaali, ei lisää siittiöiden liikkuvuutta tilastollisesti merkitsevästi missään näytteessä, kuten kuvassa 2(b) on esitetty.
(a)
(b)
(a)
(b)
DNAASI I:n vaikutukset siittiöiden liikkuvuuteen DNaasi I:n kanssa 15 minuutin inkuboinnin jälkeen. DNaasi I parantaa PR-liikettä tilastollisesti merkitsevästi hyperviskoosissa siemennesteessä (a), mutta sillä ei ole vaikutusta siittiöissä, joiden viskositeetti on normaali (b). w/o: siemenneste ilman käsittelyä, käsitelty: DNaasi I:llä käsitelty siemenneste, a: nopeasti etenevät siittiöt, b: hitaasti etenevät siittiöt, c: ei-etenevät, d: immotiili, ja PR: liikkuvuus (a+b).
Inkuboinnin jatkaminen vielä 15 minuutin ajan (21 koehenkilöllä 32:sta) (yhteensä kolmekymmentä minuuttia, t=30) lisäsi siittiöiden murto-osan motiliteettia 9,524 %:iin (t=30), kun se aiemmin oli ollut 1,761 % (t=0) (p=0,046, moninaisvertailutesti), kuten kuvasta 3 ilmenee. Mielenkiintoista on, että PR-liike parani dramaattisesti 24 prosentista (t=0) 45,047 prosenttiin (t=30) (p<0,0001, moninkertainen vertailutesti) siittiöistä. Siittiöiden (c)- ja (d)-fraktion liikkuvuus väheni tilastollisesti merkitsevästi 35,714 prosentista 22,08 prosenttiin (p=0,001, moninkertainen vertailutesti) ja 40,238 prosentista 32,238 prosenttiin (p=0,039, moninkertainen vertailutesti). Sperman viskositeetin uudelleenarviointi DNaasi I -käsittelyn jälkeen osoitti, että useimmissa tapauksissa viskositeetti oli normalisoitunut tai ainakin parantunut.
DNAASI I:n vaikutus hyperviskoosin siemennesteen motiliteettiin DNaasi I:n kanssa suoritetun 30-minuuttisen inkubaation jälkeen. DNaasi I parantaa liikettä tilastollisesti merkitsevästi hyperviskoosissa siemennesteessä, mutta vähemmän näyttävästi kuin viidentoista minuutin inkubointi. w/o: siittiöitä ilman käsittelyä, käsitelty: DNaasi I:llä käsiteltyjä siittiöitä, a: nopeasti eteneviä siittiöitä, c: ei-eteneviä, d: immotiileja ja PR: liikkuvuus (a+b).
Vertailimme tämän jälkeen DNaasi I -käsittelyä seuranneen tiheysgradienttisentrifugoinnin läpikäyneiden siittiöiden tuloksia pelkän tiheysgradienttikäsittelyn jälkeen saatuihin tuloksiin. Näytteiden rajallisuuden vuoksi näitä kahta menettelyä ei käytetty samoista koehenkilöistä kertyneisiin näytteisiin, vaan eri koehenkilöiden näytteisiin, joiden siittiöiden viskositeetti oli korkea. Tiheysgradienttisentrifugointikäsittelyä käytettiin myös kohdunsisäisessä inseminaatiossa (IUI). Kuten kuvassa 4 on esitetty, DNaasi I -käsittelyn jälkeisen tiheysgradienttisentrifugoinnin jälkeen (a) liikkeen prosenttiosuus kasvoi 3,416 prosentista 35,083 prosenttiin siittiöistä (10,27-kertainen parannus) verrattuna 6,333 prosentista 26,866 prosenttiin siittiöistä (4,242-kertainen parannus) pelkän tiheysgradienttikäsittelyn yhteydessä (p<0,0001, Kruskal-Wallisin moninkertainen Kruskal-Wallisin vertailutesti). Mitä tulee (b) liikkeeseen, DNaasi I -käsittelyn jälkeisen tiheysgradienttisentrifugoinnin jälkeen parannus oli myös tilastollisesti merkitsevä (28,583 %:sta 40,916 %:iin siittiöistä (1,43-kertainen lisäys), p=0,0112). Tiheysgradienttisentrifugointiryhmässä vastaava parannus lisääntyi 34,533 prosentista 46,466 prosenttiin siittiöistä (1,34-kertainen parannus), vaikka ryhmien välinen ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (ns, Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailutesti). Lisäksi PR-liike lisääntyi ensimmäisessä ryhmässä 32 prosentista 76 prosenttiin siittiöistä (2,375-kertainen) verrattuna 1,776-kertaiseen parannukseen toisessa ryhmässä (40,866 prosentista 72,666 prosenttiin siittiöistä) (ei tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä, Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailutesti). Siittiöiden (c) ja (d) fraktioiden liikkuvuus väheni 36,083 prosentista 10,583 prosenttiin ja 31,916 prosentista 13,583 prosenttiin. Vastaava lasku pelkän tiheysgradienttisentrifugointikäsittelyn ryhmässä oli 29,40 %:sta 14,80 %:iin (ei tilastollisesti merkitsevä ryhmien välillä, Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailutesti).
Hyperviskoottisen siemennesteen motiliteetin vertailu DGC:n jälkeen DNaasi I:llä suoritettuun käsittelyyn vs. pelkkään DGC:n. Yhdistelmähoidolla oli suurempi vaikutus siittiöiden liikkuvuuteen kuin pelkällä DGC:llä. w/o: siemenneste ilman käsittelyä, käsitelty: DNaasi I:llä käsitelty siemenneste, a: nopeasti etenevät siittiöitä, b: hitaasti etenevät siittiöitä, c: ei-etenevät, d: immotiili, ja ja PR: motiliteetti (a+b).
Pesun jälkeinen TPMSC suhteessa kunkin valmisteen alkumäärään (saanto) arvioitiin (M&M). Tiheysgradienttikäsittelyn tuotto yksilön tapauksessa, jolla ei ollut siemennesteen viskositeettia, oli 27,096 % (kuva 5, w/o V-d). Saman valmisteen saanto sellaisten yksilöiden tapauksessa, joilla on korkea viskositeetti (kuva 5, HV-d), oli 18,519 %. Muutos molemmissa tapauksissa verrattuna kontrolliin (kuva 5, w/o V, HV) oli tilastollisesti merkitsevä (p<0,0001 ja p=0,0377, Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailutesti), mikä osoitti, että DGC-käsittelyn jälkeen menetettiin paljon PR- siittiöitä. Kun korkean viskositeetin omaavista yksilöistä peräisin olevat siittiöt käsiteltiin DNaasikäsittelyllä (kuva 5, HV-DNaasi), vastaava saanto oli 42,47 %, kun taas tiheysgradienttikäsittelyn (HV-d) ja DNaasikäsittelyn (HV-DNaasi) välinen vertailu johti p<0,0001 suhteessa HV-ryhmään, moninkertainen vertailu Kruskal-Wallisin testi. Huolimatta edellä mainitun saavutuksen suuruudesta DNaasikäsittelyn yhdistelmä, jota seuraa tiheysgradienttikäsittely (kuva 5, HV-DNaasi-d), tuottaa 29,782 % (p=0,0121 suhteessa HV-ryhmään, Kruskal-Wallisin moninkertainen vertailu). Lisäksi yhdistettyä valmistetta (HV-DNaasi-d) verrattiin PR- siittiöiden prosentuaaliseen osuuteen korkean viskositeetin siemennesteessä ennen mitään käsittelyä (kuva 5, HV), ja tulokseksi saatiin p=0,448, mikä tarkoitti, että suurin osa PR- siittiöistä saatiin talteen. Lisäksi verrattuna w/oV-d-ryhmään ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa, sillä Kruskal-Wallisin moninkertaisen vertailun Kruskal-Wallisin testi p=0,619.
Erittely DGC:n, DNaasikäsittelyn ja niiden yhdistelmän saanto-%:n (TPMSC hoidon jälkeen/kokonaissiittiöt ennen käsittelyä) arvioimisesta siemennesteessä, jolla oli joko korkea tai normaali viskositeetti. w/oV-d: siemenneste, jonka viskositeetti on normaali DGC:n jälkeen, HV-d: siemenneste, jonka viskositeetti on korkea DGC:n jälkeen, HV-DNaasi: siemenneste, jonka viskositeetti on korkea DNaasikäsittelyn jälkeen, ja HV-DNaasi-d: siemenneste, jonka viskositeetti on korkea DNaasikäsittelyn jälkeen, jota seuraa DGC. w/oV: siemenneste, jonka viskositeetti on normaali ennen käsittelyä; HV: siemenneste, jonka viskositeetti on korkea ennen käsittelyä.
Seuraavaksi siemennesteen morfologian arvioinnissa DNaasi I:n kanssa suoritetun 15 minuutin inkuboinnin jälkeen normaalien siemennesteen osuus kasvaa tilastollisesti merkitsevästi 5,468 prosentista 7,25 prosenttiin, p=0,0197, kuten kuvassa 6 on esitetty. Samalla pään poikkeavuudet vähenivät 81,75 prosentista 74,937 prosenttiin (p=0,0004) ja kaulan poikkeavuudet vähenivät 22,062 prosentista 19,343 prosenttiin (p=0,0197). Hännän poikkeavuudet ja sytoplasmapisara noudattivat samaa kaavaa. Näiden morfologisten muutosten seurauksena on kohtuullista havaita merkittävä vaikutus teratozoosospermiaindeksiin (TZI). Kuten kuvassa 6 on esitetty, se laski 1,205:stä 1,084:ään (p<0,0001).
Viidentoista minuutin inkubointi DNaasi I:llä virtaviivaistaa korkeaviskoosisen siemennesteen spermatozoaalien morfologiaa ja tersatoosien tersatoosien tersatoosi-intensiteettiä. w/o: siemenneste ilman käsittelyä, käsitelty: DNaasi I:llä käsitelty siemenneste, head abn: pään poikkeavuudet, tail abn: hännän poikkeavuudet ja TZI: teratozoosospermiaindeksi.
4. Pohdinta
Tässä tutkimuksessamme oletimme, että siemennesteen yliviskositeetti johtuu NET:stä. Esitetyt tiedot osoittavat, että NETien ekstrudoituneen DNA:n pilkkominen on mahdollista, mikä johtaa siittiöiden liikkuvuuden paranemiseen. Siemennesteen plasman DNA:n entsymaattista pilkkomista tutkittiin siittiöiden liikkuvuuden lisäämiseksi, jolloin ne soveltuisivat käytettäväksi ART:ssä. DNaasi I:n käyttö siittiöiden nesteytyksen jälkeen johti sekä siittiöiden liikkuvuuden että morfologian paranemiseen. Käytettiin useita inkubaatioaikoja, jotta saavutettiin parhaat tulokset, jotka saatiin 15 minuutin inkubaation jälkeen. Tutkimuksen tavoitteena oli parantaa kohdunsisäisen keinosiemennyksen tuloksellisuutta hedelmättömien miesten kohortissa, joiden siittiöille on ominaista korkea viskositeetti, joka johtuu todennäköisesti ulostyöntyneen DNA:n aiheuttamasta esteestä. Lisäksi DNaasi I:n käyttö paransi epänormaalia morfologiaa, joka yleensä esiintyy yhdessä korkean viskositeetin kanssa. Siemennesteen rikastumista arvioitiin myös eristettyjen, sekä nopeasti että hitaasti etenevien siittiöiden lopullisen lukumäärän perusteella.
Tilastollisesti merkitsevä siittiöiden morfologian paraneminen DNaasi I:llä tehdyn hoidon jälkeen saattaa viitata siihen, että nämä poikkeavuudet ilmenevät siemensyöksyn jälkeen ja säilyvät korkeasta viskositeetista johtuen. Kun otetaan huomioon, että hyperviskoosin siemennesteen kokonaisantioksidanttikapasiteetti on alentunut , siittiöiden läsnäolo tässä ympäristössä voi aiheuttaa lipidiperoksidaatiota ja DNA-vaurioita ja lopulta morfologian heikkenemistä . Ainakin osa näistä morfologisista poikkeavuuksista osoittautui palautuviksi DNaasi I -käsittelyllä. Tämä parannus viittaa edellä mainitun hoidon optimaaliseen soveltamiseen tapauksissa, joissa ei vaadita suurta määrää suoraan liikkuvia siittiöitä, kuten kohdunsisäisessä keinosiemennyksessä, mutta joissa vaaditaan parasta mahdollista morfologiaa, kuten IVF- tai ICSI-menetelmässä hedelmöittämistä varten .
Tuloksemme osoittavat, että DNaasi I:n käyttö on tehokasta vain silloin, kun läsnä on hyperviskositeetti. Kuten kuvasta 2(b) käy ilmi, hyperviskositeetin puuttuessa DNaasi I:n käyttö ei. Normaalin viskositeetin vallitessa ja siittiöiden liikkuvuudesta riippumatta entsyymin pilkkominen ei johtanut mihinkään tilastollisesti merkitsevään eroon missään tutkituista parametreista. Sitä vastoin hyperviskoosin siemennesteen kohortissa entsyymin käyttö johti PR-motiliteetin paranemiseen tilastollisesti merkitsevällä tavalla, kuten kuvasta 2(a) käy ilmi. Lisäksi HV-ryhmässä ei ollut eroja siittiöiden liikkuvuudessa ja morfologian palautumisessa vakavan tai kohtalaisen viskositeetin mukaan, vaikka vakavan viskositeetin omaavien siemennestenäytteiden määrä oli pieni. Lisäksi, kuten kuvasta 5 käy ilmi, tilastollisesti merkitsevä ero DGC-valmistuksen jälkeen korkean viskositeetin ryhmän (HV-d) ja normaalin viskositeetin ryhmän (w/oV-d) välillä on 0,0179, mikä viittaa siihen, että parannus on saavutettavissa. Lisäksi samassa kuvassa yhdistetyn hoidon (HV-DNaasi-d) tuotto johti PR-spermaattisten siittiöiden prosenttiosuuden palautumiseen, joka saavutti vastaavien siittiöiden tason miehillä, joilla oli korkea viskositeetti (HV) ennen hoitoa, koska PR:n lopullisella prosenttimäärällä (29,782 %, HV-DNaasi-d) ensimmäisessä tapauksessa ei ole tilastollista eroa alkuperäiseen PR:hen (26,478 %, HV ennen hoitoa), p=0,4480. Tämän yhdistetyn lähestymistavan merkitys, vaikka se vähentää saantoa verrattuna pelkkään DNaasikäsittelyyn (p<0001 HV-d:n ja HV-DNaasin välillä), perusteltiin sillä, että tiheysgradienttikäsittely vähensi talteen otettujen, c- ja d-luokan siittiöiden vasta-aineita ja puhdisti ne siten. Sitä vastoin vastaava tilastollinen ero DGC-valmisteen (HV-d, 18,519 %) ja ”HV ennen käsittelyä” (26,478 %) saannon välillä oli merkitsevä (ts. p=0,0322).
Lisäksi se voisi korvata hyperviskoosin siemennesteen mekaanisen käsittelyn; näin ollen se laimennetaan tai vedetään yleisesti injektioneulaan ja työnnetään pakotetusti läpi kohonneen viskositeetin voittamiseksi. Vaikka nämä menetelmät eivät todennäköisesti ole tehokkaita, koska tällainen käsittely lisää ROS-tuotantoa . Lisäksi hyperviskositeetti korreloi negatiivisesti kromatiinin eheyden kanssa viallisena dekondensaationa, mikä on jo todettu .
Yleisesti DNaasi I:n käyttö hengitysteissä on jo saanut FDA:n lääketieteellisen hyväksynnän kystisen fibroosin tapauksessa . Lisäksi DNaasi on siemenplasman luonnollinen komponentti, jonka tehtävänä on luultavasti laimentaa naisen lisääntymisreitillä neutrofiilien rekrytoinnin jälkeen tulehduksen seurauksena muodostuneita NET:iä, ja ehdotettu menettely on mahdollisesti lääketieteellisesti sovellettavissa ART:ssä. Sen roolia korostaa myös se, että sen puuttumisella on haitallisia vaikutuksia kädellisten siemennykseen .
Hyperviskositeetti johtuu todennäköisesti joko tulehduksesta tai mistä tahansa siemennesteen rauhasten toimintahäiriöstä, vaikka tarkka mekanismi ei olekaan selvä. Se voi liittyä sukupuolielinten virusinfektioihin, kuten laboratoriomme on aiemmin osoittanut . Siemennesteen viskositeetin vähentämiseksi on sovellettu useita hoitokeinoja, mutta harvoin tulokset ovat olleet rohkaisevia . Menetelmät, kuten liiallinen nesteytys ja eturauhashieronta, eivät ole tuottaneet odotettuja tuloksia. Proteolyyttisten entsyymien, kuten alfa-kymotrypsiinin, käyttö antoi toiveikkaita tuloksia, mutta sen käyttöä ei ole otettu käyttöön .
Toisessa tutkimuksessa käytettiin DNaasi I:tä viskositeetin alentamiseen, mutta lopulliset tulokset eivät olleet tältä osin onnistuneita. Kirjoittajat eivät tutkineet laadullisia siittiöparametreja eli liikkuvuutta. Lisäksi inkubaatioaika oli paljon pidempi (yksi tunti) kuin ehdottamamme (viisitoista minuuttia), joten neutraali vaikutus viskositeettiin saattoi mahdollisesti johtua entsyymin pidemmästä inkubaatiosta siemennesteen plasman kanssa.
Loppujen lopuksi huolimatta tiedoista, joiden mukaan siemennesteen hyperviskositeetti on korreloinut miehen sukupuolielinten tulehduksen kanssa, ts, siemennesteen rakkuloihin, mikä on johtanut antibioottien ja antioksidanttien käyttöön, näillä hoitomuodoilla on voitu hoitaa tätä tilaa vain niissä tapauksissa, joissa pääasiallinen tekijä oli tulehdus. Yleensä sen aiheuttavat eri tekijät, jotka vaikuttavat synergistisesti, ja siksi hyperviskositeetille ei ole olemassa suoraa aiheuttavaa hoitoa.
Tulehdusärsykkeille altistuessaan neutrofiilit, siemennesteen pääasiallinen leukosyyttipopulaatio, harjoittavat suojaavaa tehtäväänsä inaktivoimalla bakteereja fagosytoosin avulla ja tappamalla niitä sen jälkeen altistumalla proteolyyttisille entsyymeille ja ROS:lle. Toinen toimintatapa, jolla neutrofiilit voivat neutraloida patogeenejä, on neutrofiilien solunulkoisten ansojen (NET) tuottaminen. NET:t ovat pääasiassa kromatiinista koostuvia kolmiulotteisia kuituverkostoja, jotka voivat vangita ja immobilisoida mikro-organismeja. NET:ien on osoitettu olevan herkkiä DNaasin mutta ei proteaasin hajoamiselle . Koska NET:ien muodostuminen perustuu DNA:han ja siemennesteen DNaasin on osoitettu pilkkovan ulostyöntynyttä DNA:ta ja vapauttavan kietoutuneita siittiöitä, oletimme, että eksogeenisen DNaasin käyttö voisi osoittautua arvokkaaksi hoidoksi tapauksissa, joissa siemennesteen hyperviskositeetti johtuu pääasiassa solunulkoisesta, alttiina olevasta neutrofiilien DNA:sta.
Patofysiologian kannalta käsitys, jonka mukaan hyperviskositeetti johtuu tulehduksesta, on melkein vakiintunut. Tulehdusreaktiot käsittävät neutrofiileistä muodostuvien NETien muodostumisen mikro-organismien vangitsemiseksi. On hyvin todennäköistä, että siittiöt kuluttavat paljon energiaa yrittäessään vapautua NET:istä, ja näin ollen niiden hapettumisen ja apoptoottisen tilan tutkiminen on erittäin tärkeää. Lisäksi jo kuvattu ”loukkuvaikutus” on seurausta siittiöiden liikkumisen estämisestä, joka johtuu niiden takertumisesta NET:iin.
Tässä tutkimuksessa yritimme lyysiä siemenplasman solunulkoista DNA:ta, joka on NET:ien pääkomponentti, DNaasi I:llä tarkoituksenamme vapauttaa ne NET:istä ja palauttaa siittiöiden laatuparametrit eli liikkuvuus ja morfologia. Lisäksi, kuten kuvasta 1 käy ilmi, WBC-pitoisuuden ja viskositeettiluokan välillä on tilastollisesti merkitsevä ero. Ehdotettu hoito rajoittuu postejakulaatiovaiheeseen eikä kliiniseen. Lisäksi alkuperäinen hypoteesi, jonka mukaan siittiöiden lisääntynyt viskositeetti johtui DNA:n läsnäolosta siemennesteessä, varmistui, vaikka lisätutkimuksia tarvitaankin tämän hypoteesin vahvistamiseksi. Ottaen huomioon, että rekrytoidut neutrofiilit muodostavat NET:iä tulehtuneisiin kohtiin, oletimme, että siemennesteessä oleva DNA on peräisin neutrofiileistä. Vaikka emme esittäneet suoraa todistetta, joka tukisi tätä olettamusta, katsomme, että tietojemme mukaan tärkein mahdollinen DNA:n lähde on neutrofiilien kromatiini, joka purkautuu tulehduksen yhteydessä.
5. Johtopäätökset
Tutkimustuloksemme tukevat päätelmää, jonka mukaan DNaasi I -hoito parantaa tilastollisesti merkitsevästi siittiöiden liikkuvuutta ja morfologiaa. Se parantaa sperman perusparametreja ART:n kannalta eli motiliteettia ja morfologiaa vain hyperviskoottisen siemennesteen tapauksessa. Lisäksi havaintomme viittaavat siihen, että SHV:n pääasiallinen syy on NET:ien muodostuminen, ja näin ollen ehdotamme tämän lähestymistavan terapeuttista potentiaalia ja hyödyllisyyttä.
Tietojen saatavuus
Tässä tutkimuksessa tehtyjen havaintojen tueksi käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta kirjoittajalta.
Eettinen hyväksyntä
Kaikki tässä tutkimuksessa suoritetut ja ihmisosallistujia koskevat menettelyt olivat Ateenan kansallisen Kapodistrian yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan bioetiikka- ja deontologiatoimikunnan eettisten standardien mukaisia, jotka hyväksyttiin tammikuussa 2014 (viitenumero: 1130).
Suostumus
Kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksensa ennen osallistumistaan tutkimukseen.
Esintressiristiriidat
Kaikki kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia taloudellisia intressejä.
Tekijöiden kontribuutiot
Angelos D. Gritzapis ja Vassilis Tsilivakos ideoivat tutkimuksen. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis ja Vassilis Tsilivakos suorittivat tiedonhankinnan, osallistuivat sen suunnitteluun ja laativat käsikirjoituksen. Effrosyni Nosi suoritti immunomääritykset ja Angelos D. Gritzapis tilastollisen analyysin. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti ja Vassilis Tsilivakos osallistuivat tietojen analysointiin ja tulkintaan. Kaikki kirjoittajat lukivat ja hyväksyivät käsikirjoituksen lopullisen version.
Kiitokset
Tämän projektin rahoitti kliinisen diagnostiikan laboratorio, Locus Medicus S.A.
.