Fertiilejä jälkeläisiä steriileistä sukupuolikromosomitrisomihiiristä
Trisomieläimet menettävät kolmannen kromosomin
Kun nisäkkäiden normaaliin kahteen sukupuolikromosomiin (nartuilla XX ja uroksilla XY) lisätään kolmas sukupuolikromosomi, syntyy kehityshäiriöitä. Sukupuolikromosomeiltaan trisomiset hiiret ovat hedelmättömiä. Hirota ym. osoittavat, että ohjelmoimalla uudelleen soluja steriileistä hiiristä, joilla on kromosomitrisomia XXY tai XYY, saadaan aikaan XY-kantasoluja. Näistä XY-kantasoluista tuotetuista siittiöistä voisi syntyä terveitä, hedelmällisiä jälkeläisiä. Uudelleenohjelmointi edisti ylimääräisen kromosomin häviämistä myös Klinefelterin (XXY) tai Downin (trisomia 21) oireyhtymää sairastavien potilaiden soluissa.
Science, tämän numeron s. 932
Abstract
Oikea kromosomimäärä on elintärkeä normaalille kehitykselle ja terveydelle. Sukupuolikromosomien trisomiaa esiintyy 0,1 %:lla ihmisväestöstä, ja se liittyy hedelmättömyyteen. Osoitamme, että uudelleenohjelmoinnin aikana indusoiduiksi pluripotentteiksi kantasoluiksi (iPSC) steriileistä trisomisista XXY- ja XYY-hiiristä peräisin olevat fibroblastit menettävät ylimääräisen sukupuolikromosomin ilmiön kautta, jota kutsumme trisomian aiheuttamaksi kromosomikadoksi (TCL). Tuloksena syntyvät euploidiset XY iPSC:t voidaan erilaistaa miehen sukusolulinjaksi ja toiminnallisiksi siittiöiksi, joita voidaan käyttää intrasytoplasmisessa spermainjektiossa tuottamaan kromosomaalisesti normaaleja, hedelmällisiä jälkeläisiä. Sukupuolikromosomien häviäminen on verrattain harvinaista hiiren XX- ja XY-iPSC:n tuottamisen aikana. TCL:ää sovelletaan myös muihin kromosomeihin, ja se tuottaa euploideja iPSC-soluja Downin syndrooma -hiirimallin soluista. Sillä voidaan myös luoda euploideja iPSC-soluja ihmisen trisomipotilaan fibroblasteista. Tuloksilla on merkitystä lapsettomuuden ja muiden trisomisten fenotyyppien voittamisessa.
Nisäkkäiden sukupuolikromosomeilla on erikoistuneet roolit uroksen (XY) ja naisen (XX) sukusolujen kehityksessä (1). Sukupuolikromosomipoikkeavuudet ovat ihmisen hedelmättömyyden yleisin geneettinen syy (2). Sukupuolikromosomitrisomioissa (SCT) Klinefelterin (XXY) ja kaksois-Y:n (XYY) oireyhtymässä spermatogeneesi häiriintyy X- ja Y-geenien ylimäärän vuoksi (2). XYY-miehet ovat yleisesti hedelmällisiä ylimääräisen sukupuolikromosomin spontaanin häviämisen vuoksi (mosaiikismi). XXY-miehillä mosaiikismi on harvinaisempaa. Kiveksen siemennesteen talteenotto on mahdollistanut joidenkin nuorten Klinefelter-miesten lisääntymisen, mutta vanhemmilla potilailla se ei ole onnistunut yhtä hyvin (3, 4). XXY- ja XYY-yksilöt, joilla ei ole XY:n sukusoluja, ovat hedelmättömiä.
Tutkittaessa SCT-hedelmättömyyttä tuotimme aikuisia XXY- ja XYY-hiiriä, joilla oli fluoresoivia reportteritransgeenejä Blimp1-mVenus (BV) ja Stella-ECFP (SC) (5), jotta voimme valvoa pluripotenttien kantasolujen erilaistumista primordiaalisiksi sukusolujen kaltaisiksi soluiksi (PGCLC) (6). XXY-urokset luotiin parittamalla villityyppinen naaras sukupuolikromosomivariantti uroksen kanssa, joka tuottaa XY-pitoisia siittiöitä (kuva S1). XYY-hiirten tuottaminen edellyttää Y-kromosomin periytymistä molemmilta vanhemmilta. Siksi käytimme isän puolelta periytyvää villityyppistä Y-kromosomia ja äidin puolelta periytyvää Yd1-kromosomia, joka ei ilmentäisi kivesten määräävää Sry:tä (kuva S1) (7). Kuten aiemmin on osoitettu (8, 9), spermatogeneesin fenotyyppi molemmissa malleissa vastasi SCT-ihmisten fenotyyppiä, ja XXY-hiirillä se pysähtyi prospermatogonivaiheessa ja XYY-hiirillä pachynemassa (kuva S2). Spermatogeneesi oli normaali euploidissa XY BVSC-siirtogeenisissä sisaruksissa.
Seuraavaksi perustimme fibroblasteja SCT- ja kontrolli-XY- ja XX-hiiristä (kuva 1A). X-geenin Slx:n ja Y-geenin Sly:n DNA-fluoresenssi in situ -hybridisaatio (DNA-FISH) vahvisti, että läpikäynti 4 (P4) SCT- ja kontrollifibroblastit olivat säilyttäneet alkuperäiset sukupuolikromosomikomplementtinsa (Kuva 1B ja Kuva S3A). Fibroblastit ohjelmoitiin uudelleen indusoiduiksi pluripotentteiksi kantasoluiksi (iPSC) (10) doksisykliinillä (Dox) indusoitavalla tavalla. DNA-FISH suoritettiin tuloksena syntyneille P2-iPSC-soluille (kuva 1A).
(A) Kokeellinen kaavio XXY-, XYY-, XY- ja XX-iPSC-solujen tuottamiseksi. 2i, GSK3ß:n ja Mek1/2:n estäjät; LIF, leukemiaa estävä tekijä. (B-D) Slx (vihreä) ja Sly (magenta) DNA-FISH (B) XXY- ja XYY-hiirten fibroblasteista ja P2 iPSC:istä (n = 50 solua). Mittakaavapalkit, 5 μm. (E) P2 iPSC:n sukupuolikromosomikomplementit. Kukin palkki edustaa iPSC-linjaa ja niiden solujen prosenttiosuutta, joilla on kukin komplementti (n = 50 solua linjaa kohti). Suluissa olevat numerot osoittavat tutkittujen iPSC-linjojen lukumäärän. Tiedot kahdesta eläimestä yhteensä.
Suurella osalla SCT:stä peräisin olevista iPSC-linjoista esiintyi sukupuolikromosomikatoa. XXY-hiiristä havaittiin XY-, XX- ja XO- iPSC-linjoja (Kuva 1, C ja E). Menetysten esiintyvyys oli samanlainen X- ja Y-kromosomeilla (P = 0,062, Mann-Whitneyn testi). XYY-hiiristä havaittiin XY- ja XO- iPSC:tä (Kuva 1, D ja E). XYY-uroksilla Y-kromosomin häviäminen tapahtui samalla taajuudella kuin XXY-uroksilla havaittu X- ja Y-kromosomien häviäminen yhdessä (P = 0,089, Mann-Whitneyn testi). Tämän jälkeen verrattiin sukupuolikromosomikadon esiintyvyyttä SCT:stä peräisin olevien ja euploidisten XY- ja XX-alkuisten iPSC:iden välillä. Sukupuolikromosomikato oli yleisempää SCT- kuin euploidista peräisin olevissa iPSC-soluissa (kuva 1E) riippumatta siitä, mitä raja-arvoa käytettiin sukupuolikromosomikaton määrittelyssä (kuva S12D).
Sukupuolikromosomikato voisi tapahtua SCT-solujen uudelleenohjelmoinnin tai iPSC:n P2:ksi kasvattamisen aikana, mikä voisi ehkä antaa syntyneille euploidisille soluille proliferatiivisen edun. Sukupuolikromosomien epästabiilisuutta onkin havaittu pluripotenteissa kantasoluissa (11, 12). Jälkimmäisen hypoteesin testaamiseksi analysoimme sukupuolen kromosomistabiilisuutta P2:n ja P6:n välillä iPSC-soluissa, joiden komplementit olivat hyvin parentaalisia (>90 %) (kuva S4A). Havaitsimme sukupuolikromosomikatoa XX- ja XXY- iPSC-linjoissa (P < 0,01 ja 0,05 vastaavasti; Wilcoxonin signed-rank-testi) mutta ei XY- ja XYY- iPSC-linjoissa (P = 0,21 ja 0,66 vastaavasti; Wilcoxonin signed-rank-testi). Yksikään iPSC-linja ei kuitenkaan osoittanut yli 15 prosentin laskua vanhempien komplementissa (kuva S4B). Lisäksi sukupuolen kromosomikato P2:n ja P6:n välillä ei ollut trisomiapainotteinen (kuva S4B). SCT:stä peräisin olevilla euploidisilla XY-ipSC-yksilöillä ei myöskään ollut proliferatiivista etua XXY- tai XYY-ipSC-yksilöihin verrattuna (kuva S5). Koska SCT-fibroblastit olivat myös karyotyyppisesti stabiileja (kuva 1B ja kuva S3A), kromosomikato on todennäköisesti indusoitunut iPSC:n uudelleenohjelmoinnin aikana ja eroaa siten pluripotenttien kantasolujen sukupuolikromosomiston epävakaudesta (11, 12). Viittaamme ilmiöön nimellä trisomiapainotteinen kromosomikato (TCL).
Seuraavaksi määrittelimme, muodostaisivatko SCT-fibroblasteista johdetut euploidiset XY-iPSC:t toiminnallisia siittiöitä. Valitsimme erittäin euploidiset (≥80 % soluista XY) P6 iPSC:t, jotka oli mukautettu Dox-vapaaseen väliaineeseen (kuva S6). XYY-kokeissamme PGCLC-kokeisiin käytettiin vain XY- iPSC-linjoja, jotka säilyttivät villityyppisen Y- eikä Yd1-kromosomin (kuva S7). Karyotyypin määritys vahvisti, että kaikki SCT:stä saadut XY- iPSC-linjat ja kontrolli-XY- iPSC-linja olivat euploideja (kuva S8). Nämä iPSC-linjat erilaistettiin (6) epiblastin kaltaisen tilan kautta BV- ja SC-positiivisten PGCLC-aggregaattien luomiseksi (kuva 2A). BV-positiiviset PGCLC:t (taulukko S1) eristettiin fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla (FACS) (kuva 2B) ja siirrettiin sukusolupuutteisiin W/Wv (Kit-mutantti) -kiveksiin (13).
Spermatogeneesi arvioitiin vastaanottajissa 9-10 viikkoa siirron jälkeen. Teratoomia, joita havaitaan iPSC-peräisten PGCLC-siirtojen jälkeen (6), esiintyi 29 %:lla XXY-peräisistä ja 50 %:lla XYY-peräisistä siirretyistä linjoista (kuva S9). Spermatogeneesin palautuminen, joka ilmeni spermatogeenisten pesäkkeiden läsnäolosta (kuva 2C) ja histologiasta (kuva 2D), havaittiin kaikilla käytetyillä XXY- ja XYY-alkuisilla iPSC-linjoilla (taulukko 1). Näin ollen SCT:stä peräisin olevat XY:n iPSC:t voivat erilaistua sukusoluiksi in vitro ja saattaa spermatogeneesin päätökseen siirron jälkeen.
- Katso ponnahdusikkuna
- Katso rivissä
Kysyimme, voisivatko siirrolla luodut siittiöt tukea lisääntymistä. Sytoplasmasisäinen siittiöinjektio (ICSI), jossa käytettiin kahdesta XXY- ja kahdesta XYY-alkuisesta XY iPSC-linjasta peräisin olevia siittiöitä (kuva 2E ja kuva S10A), tuotti zygootteja, jotka kehittyivät kaksisoluisiksi alkioiksi in vitro (tehokkuus 76.7-87,3 %) (kuva 2F, kuva S10B ja taulukko S2) ja täysin normaaleja jälkeläisiä, kun ne siirrettiin vastaanottajille (tehokkuus 46,9-59,4 %) (kuva 2G, kuva S10C ja taulukko S2). Polymeraasiketjureaktiogenotyypin määritys vahvisti, että jälkeläiset olivat peräisin siirretyistä PGCLC:istä (kuva S10D). XXY- ja XYY-alkuisista iPSC-linjoista peräisin olevat poikaset osoittivat vertailukelpoista kasvua kuin XY-kontrollin iPSC-linjoista peräisin olevat poikaset (kuva S10E). Huomionarvoista on, että XXY- ja XYY-peräisillä poikasilla oli euploidinen (XY tai XX) komplementti (kuva S11). Kolme kypsää urosta ja kolme naarasta kustakin XXY- ja XYY-alkuisesta iPSC-linjasta paritettiin keskenään, ja kaikki olivat hedelmällisiä (kuva 2H ja kuva S10F). Näin ollen SCT:stä peräisin olevista XY:n iPSC-linjoista saadut siittiöt synnyttävät kromosomaalisesti normaaleja, terveitä ja hedelmällisiä jälkeläisiä.
Kysyimme, onko TCL spesifinen sukupuolikromosomien trisomialle. Koska hiirimalleja, joissa on täydellisen autosomin trisomia, ei ole saatavilla (14), toistimme kokeemme urospuolisilla Tc1-transkromosomihiirillä, Downin oireyhtymämallilla, jossa on ylimääräinen ihmisen kromosomi 21 (hChr.21) (15). Tc1-hiiret kantavat hChr.21-insertoitua neomysiiniresistenssikasettia, jonka valinta vähentää hChr.21-mosaikismia (15). Tämän vuoksi rikastimme ensin aikuiset Tc1- fibroblastit hChr.21:n esiintymisen varalta käyttämällä neomysiinianalogia G418 (kuva 3A). DNA-FISH osoitti, että valtaosa (≥96 %) Tc1-fibroblasteista säilytti hChr.21:n (kuva 3B ja kuva S3B). Nämä Tc1-fibroblastit ohjelmoitiin uudelleen ilman G418-valintaa, ja tuloksena syntyneet iPSC:t analysoitiin P2:ssa. Kymmenessä tuotetuista 16:sta iPSC-linjasta (62,5 %) havaittiin hChr.21:n häviäminen ≥10 %:ssa soluista (kuva 3, C ja D ja kuva S12D). Sitä vastoin G418:n poistamisen jälkeen hChr.21 säilyi Tc1- fibroblasteissa, joita viljeltiin saman ajanjakson ajan kuin iPSC:n uudelleenohjelmoinnissa käytettiin (18 päivää), ja P6:n iPSC-linjoissa, joilla oli P2:ssa erittäin parentaalinen (>90 % hChr.21-positiivinen) komplementti (kuva S12, A ja B). Päättelemme, että hChr.21:n häviämistä Tc1-soluissa edistää pikemminkin uudelleenohjelmointi kuin G418:n poisto ja että TCL vaikuttaa näin ollen myös liitännäiskromosomiin.
(A) Kokeellinen kaavio Tc1-ipSC:iden tuottamiseksi. (B ja C) Slx (vihreä) ja hChr.21 (magenta) DNA-FISH (B) fibroblasteista ja (C) P2 iPSC:istä Tc1-hiiristä (n = 50 solua). Mittakaavapalkit, 5 μm. (D) P2 iPSC:n kromosomikomplementit. Kukin palkki edustaa iPSC-linjaa ja kunkin komplementin sisältävien solujen prosenttiosuutta (n = 50 solua linjaa kohti). Suluissa olevat numerot osoittavat tutkittujen iPSC-linjojen lukumäärän. Kahden eläimen tiedot yhdistetty.
Kysyimme seuraavaksi, esiintyykö TCL:ää ihmisen soluissa. Kromosomikatoa on havaittu ihmisen trisomisten solujen viljelyn aikana (16, 17), mutta sen yleisyyttä ja suhdetta uudelleenohjelmointiin ei ole systemaattisesti analysoitu. Valitsimme ihmisen Klinefelterin oireyhtymä-, Downin oireyhtymä- ja euploidiset XY- ja XX-fibroblastilinjat, joilla oli minimaalinen mosaiikismi (kuva S13, A ja D), ohjelmoimme ne uudelleen ja määrittelimme tuloksena saatujen iPSC-linjojen kromosomikomplementit. Havaitsimme Klinefelterin oireyhtymän fibroblasteista peräisin olevia XY- ja XX- iPSC-linjoja ja Downin oireyhtymän fibroblasteista peräisin olevia euploideja iPSC-linjoja (kuva S13, B, C, F ja G). Kromosomikato oli yleisempää trisomisissa kuin disomisissa soluissa, mikä osoittaa, että TCL:ää esiintyy myös ihmisen uudelleenohjelmoinnin aikana. Erittäin euploidisten iPSC-linjojen esiintymistiheys oli kuitenkin alhaisempi kuin hiirten trisomiasta peräisin olevissa iPSC-linjoissa (kuva S13, F-H).
Olemme osoittaneet, että TCL tuottaa euploidisia iPSC-linjoja SCT-hiiristä ja autosomaalisista trisomioista hiiristä ja potilaista (kuva S12E). Hiirillä tuloksena saadut ”korjatut” iPSC:t voivat muodostaa toiminnallisia siittiöitä, mikä mahdollistaa kromosomaalisesti euploidien jälkeläisten tuottamisen hedelmättömiltä SCT-henkilöiltä. TCL täydentää nykyisiä iPSC-hoitoja kromosomipoikkeavuuksien hoitoon (17-21). TCL:n aiheuttavia mekanismeja ei tunneta. Uudelleenohjelmointiin liittyvät solustressit saattavat valikoitua trisomisia soluja vastaan, mikä mahdollistaa euploidisten solujen syntymisen. Havaitsimme harvemmin TCL:ää ihmisen soluissa kuin hiiren soluissa (kuvat S12D ja S13H). Vaikka TCL olisi harvinaista, se voisi tarjota hoitoja hedelmättömille SCT-potilaille, joiden kohdalla vaihtoehtoiset lähestymistavat eivät ole tuottaneet tulosta. In vitro tehtyjen ihmisen sukusolujen kliinistä käyttöä olisi kuitenkin harkittava huolellisesti eettisesti ja oikeudellisesti (22-24). Lisäksi on kehitettävä täydellinen in vitro -spermatogeneesi, jotta vältettäisiin sukusolusiirrosta aiheutuvan teratooman muodostumisen riski.
TCL mahdollistaa myös naispuolisten iPSC-solujen tuottamisen miehistä, mikä tarjoaa mahdollisuuksia sukupuolisen dimorfismin geneettiseen tutkimiseen (25). Luomalla isogeenisiä iPSC-linjoja, jotka eroavat toisistaan vain sukupuolikromosomiensa suhteen, voitaisiin iPSC-tautien mallintamisen aikana havaitut sukupuolierot liittää X- tai Y-kromosomivaikutuksiin.
Lisäaineisto
Materiaalit ja menetelmät
Kuvat. S1-S13
Taulukot S1-S3
Viitteet (26-34)
Tämä artikkeli on jaettu Science Journals Default License -lisenssin ehtojen mukaisesti.