Abstract

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia Exiguobacterium sp. kannan 12/1 (DSM 21148) tuottamien orgaanisten happojen merkitystä juomateollisuudesta peräisin olevan emäksisen jäteveden neutraloinnissa. Tämän bakteerin tiedetään pystyvän kasvamaan väliaineessa, jonka pH on jopa pH 12,0, ja neutraloimaan emäksisiä teollisuusjätevesiä pH 12,0:sta pH 7,5:een. FT-IR-spektroskopian avulla tehty alustava tutkimus väliaineessa esiintyvien funktionaalisten ryhmien tyypistä paljasti karbonyyli- ja hydroksyyliryhmiä vastaavat piikit, jotka viittaavat karboksyylihapon tai siihen liittyvän aineenvaihduntatuotteen (tai -tuotteiden) vapautumiseen. Spesifisen karboksyyliryhmän tunnistaminen RP-HPLC:n avulla osoitti, että viljelmän supernatantissa oli yksi piikki, jonka retentioaika muistutti eniten muurahaishappoa. Eri hiililähteillä tuotetun hapon pitoisuutta tutkittiin ajan funktiona. Vaikka happoa esiintyi samassa loppupitoisuudessa, hapon tuotantonopeus oli suurin sakkaroosilla täydennetyssä väliaineessa, jota seurasivat fruktoosi ja glukoosi. Bakteerin aineenvaihduntatuotteiden tuntemusta voidaan pitää ensimmäisenä askeleena kohti sen potentiaalin toteutumista juomateollisuuden emäksisten jätevesien laajamittaisessa bioremediaatiossa.

1. Johdanto

Alkalifiiliset mikro-organismit – mikro-organismit, joiden kasvun pH-optimi on vähintään pH 9 – ovat vaikuttaneet suuresti teollisiin sovelluksiin. Biologiset pesuaineet sisältävät entsyymejä, kuten alkalisellulaaseja ja/tai alkaliproteaaseja, joita on tuotettu alkalifiiliksistä . Alkalifiilisiä on hyödynnetty myös sellaisten entsyymien teolliseen tuotantoon, joista voi olla erityistä hyötyä, esimerkiksi syklodekstriiniä emäksisellä syklomaltodekstriiniglukanotransferaasilla ja emäksistä aktiivista maltoheksaoosia muodostavaa α-amylaasia, joita käytetään elintarvike-, kemian- ja lääketeollisuudessa. On raportoitu, että alkalikäsiteltyä puumassaa voitaisiin valkaista biologisesti alkalifiilisten tuottamilla ksylanaaseilla. Fujiwara ja työtoverit ovat raportoineet emäksisen proteaasin käytöstä röntgenfilmien hyytelömäisen päällysteen hajottamiseen, josta saatiin talteen hopeaa. Alkalifiiliset bakteerit ovat myös osoittaneet potentiaalinsa erilaisten orgaanisten yhdisteiden biohajoamisessa .

Niinpä alkalifiiliset bakteerit ovat herättäneet paljon kiinnostusta niiden solunulkoisten entsyymien ja biokemiallisten ominaisuuksien, kuten alkalifilian ja alkalistabiilisuuden, vuoksi. Niiden bioenergetiikkaa on myös tutkittu jonkin verran , mutta niiden fysiologiasta, esimerkiksi solunsisäisistä entsyymeistä ja aineenvaihduntatuotteista, tiedetään vain vähän. Välivaiheen aineenvaihduntaprosessin ominaisuudet ovat tärkeitä, koska ne auttavat luonnehtimaan bakteeria, sen entsyymikoostumusta, solujen aineenvaihduntavaihetta ja aineenvaihduntatekniikan mahdollisuuksia. Alkalifiilien kykyä vaihdella voimakkaasti hiilihydraattipitoisen väliaineen pH:ta hyödynnettiin aiemmassa työssä juomateollisuudesta peräisin olevan erittäin emäksisen jäteveden neutraloimiseksi Exiguobacterium sp. -kannan 12/1 avulla. Exiguobacterium-suku kuuluu Bacillales-sukuun, johon kuuluu myös Bacillus-suvun jäseniä. Exiguobacterium sp. 12/1 on fakultatiivinen alkalifiili, joka kasvaa optimaalisesti pH 10:ssä ja pystyy neutraloimaan emäksistä jätevettä laskemalla sen pH 12,0:sta pH 7,5:een. Oletetaan, että bakteeri vapauttaa jotakin hapanta aineenvaihduntatuotetta tai -tuotteita neutraloidakseen erittäin emäksisen ulkoisen väliaineen. On kuitenkin tärkeää luonnehtia solunulkoiseen väliaineeseen vapautuvien aineenvaihduntatuotteiden tyyppi. Tässä tutkimme orgaanisten happojen tuotantoa mahdollisena mekanismina emäksen neutraloinnissa. Tällaiset tutkimukset ovat välttämättömiä, ennen kuin bakteerin laajamittaisia sovelluksia juomateollisuuden emäksisen jäteveden neutralointiin voidaan kehittää.

Virvoitusjuomateollisuuden jäteveden pääasiallinen hiililähde on sakkaroosi (glukoosia ja fruktoosia sisältävä disakkaridi), joka on myös sen biokemiallisen hapenkulutuksen (BHK) pääasiallinen aiheuttaja. Virvoitusjuomateollisuuden jäteveden keskimääräinen BOD on 600-4500 mg/l, mikä vastaa 673-5052 ppm sakkaroosia. Kirjallisuustutkimus lukuisten yksinkertaisilla sokereilla kasvavien bakteerien aineenvaihduntatuotteista viittaa siihen, että bakteerit voisivat käyttää näitä yksinkertaisia sokereita orgaanisten happojen tuottamiseen. Tätä tukee myös muiden alkalifiilisten Bacillus-lajien solunulkoisten aineenvaihduntatuotteiden analyysi. Sakkaroosin hiililähteestä tuotettu tärkein orgaaninen happo näissä tutkimuksissa oli etikkahappo. Muurahaishappo on neutrofiilisten bakteerien yleinen metaboliitti anaerobisissa olosuhteissa, kun taas B. circulans var. alkalophilus tuottaa sitä jopa 2 g/l jopa aerobisissa viljelmissä. Muut haihtuvat hapot, kuten propionihappo, voihappo, isovoihappo ja isovaleerihappo, ovat tyypillisiä kannoille Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus ja Bacillus sp. 17-1. Isovoihappoa ja isovaleerihappoa on raportoitu useiden neutrofiilisten bakteerien elatusaineissa. Näiden happojen sekä propioni- ja voihappojen katsotaan kuitenkin olevan peräisin aminohapoista Clostridium sp. -bakteerilla tehtyjen tutkimusten perusteella. Neutrofiiliset bakteerit tuottavat melko yleisesti maito- ja palorypälehappoa, mutta Bacilluksen tuottama meripihkahappo on harvinaista. Etanolia ei ole havaittu alkalifiilisissä bakteereissa, vaikka se on tyypillinen tuote monien neutrofiilisten bakteerien glukoosiviljelmissä. Näin ollen emäksiset kasvuolosuhteet voivat vaikuttaa neutraalien aineenvaihduntatuotteiden tuotantoon . Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet käänteisfaasisuurtehonestekromatografiaa tutkiaksemme Exiguobacterium sp. kannan 12/1 tuottamien happojen tyyppiä ja pitoisuutta neutraloitaessa korkeaa pH:ta sisältävää elatusainetta, joka sisältää erityyppisiä hiililähteitä.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1 . Kanta ja viljelyolosuhteet

Exiguobacterium sp. 12/1 -viljelmä saatiin DSMZ:ltä (DSM 21148) ja sitä ylläpidettiin glyserolivarastona. Kanta 12/1:n rutiiniviljelyyn 37 °C:ssa käytettiin emäksistä perusmediumia (ABM), joka sisälsi (kaikki pitoisuudet g/l): peptonia 1, hiivauutetta 0,5, glukoosia 1, K2HPO4 0,1, Na2CO3 1, pH 10 (kolme viimeistä komponenttia lisättiin autoklavoituun väliaineeseen erikseen steriloidusta liuoksesta). IR- ja RP-HPLC-analyysejä varten bakteeria kasvatettiin 37 °C:ssa ja 200 rpm:n kierrosnopeudella minimaalisuolaisessa väliaineessa (MSM), joka sisälsi (kaikki pitoisuudet mM:nä): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA-dinatriumsuola, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 ja 1 % (w/v) yhtä seuraavista hiilihydraateista: glukoosi, fruktoosi tai sakkaroosi (kaikki komponentit lisättiin erikseen autoklavoiduista väkevistä kantaliuoksista). Nesteen lopullinen pH säädettiin 10,5:een 1 N NaOH:lla.

2.2. Kasvun ja viljelyn pH:n analysointi

1 ml ABM:ssä olevaa log-faasiviljelmää käytettiin esiviljelmien (50 ml) (1 % sokeria sisältävä MSM) inokulointiin. Varsinaiseen testiviljelyyn (250 ml lihaluujauhetta 500 ml:n Erlenmeyer-pullossa) istutettiin koko esiviljely keskimmäisessä log-faasissa (O.D. ~ 1,2). Kukin viljelysarja koostui kolmesta pullosta. Bakteerien kasvun mittarina käytettiin näytteiden absorbanssia 650 nm:ssä. pH määritettiin soluvapaista viljelynäytteistä huoneenlämmössä sen jälkeen, kun niitä oli sentrifugoitu 4000 ×g 20 minuutin ajan.

2.3. FT-IR-analyysi

Viljelmä korjattiin 60 tunnin kasvun jälkeen ja sentrifugoitiin 4000 ×g:ssä 20 minuutin ajan. IR-analyysia varten viljelmän supernatantti pakastekuivattiin ja murskattiin jauheeksi. Jauhettu supernatantti sekoitettiin sitten kaliumbromidiin, ja seos puristettiin tabletiksi. Lopuksi tabletti analysoitiin FT/IR-4200-spektrometrillä (JASCO, Tokio, Japani).

2.4. RP-HPLC-analyysi

Kulttuuri korjattiin eri ajankohtina ja sentrifugoitiin 4000 ×g:ssä 20 minuutin ajan. HPLC-analyysiä varten viljelmän supernatantti suodatettiin 0,22 μm:n suodattimen läpi ja 10 μl suodatettua näytettä injektoitiin HPLC-kolonniin.

Analyyttinen standardilaatuinen muurahaishappo, etikkahappo, meripihkahappo, propionihappo, maitohappo ja isobutaanihappo saatiin Sigmasta. Varastostandardiliuokset (100 mg/ml tai 100 μl/ml) valmistettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa myöhempää käyttöä varten. Työskentelystandardiliuokset (10 mg/ml tai 10 μl/ml) valmistettiin päivittäin. Kunkin yhdisteen ja näytteiden puskuri- ja kantaliuosten valmistukseen käytettiin Milli-Q-vettä (Millipore). Varastoliuokset, näytteet ja puskuri suodatettiin selluloosakalvosuodattimien Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA) läpi. Liuottimet kaasunpoistettiin tyhjiössä ennen käyttöä.

Orgaanisten happojen analyysi tehtiin Tormon ja Izcon menetelmän mukaisesti. Analyysi suoritettiin Breeze-järjestelmällä (Waters, Mildford, MA, USA), joka koostui 1525-binäärisestä HPLC-pumpusta, 717 plus -autosamplerista ja 2487-kaksikanavaisesta UV-detektorista, joka on asetettu 210 nm:iin ja jota käytettiin Breeze-ohjelmiston avulla. Erottelu suoritettiin Atlantis dC18 -kolonnilla (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. Päivittäin valmistettiin 20 mM NaH2PO4:ää, joka oli säädetty fosforihapolla pH-arvoon 2,20, ja se suodatettiin 0,2 μm:n hydrofiilisten kalvojen (Millipore) läpi. Liuotinohjelmassa käytettiin kahta säiliötä, jotka sisälsivät 1 % asetonitriiliä 20 mM fosfaattipuskurissa, joka oli säädetty fosforihapolla pH 2,20:een (liuotin A) ja asetonitriiliä (liuotin B); virtausnopeudeksi asetettiin 1,5 ml/min huoneenlämmössä. Gradienttiohjelma aloitettiin 100 %:lla liuottimesta A, ja 7 minuutin kuluttua liuotin B:tä lisättiin lineaarisesti niin, että 5 minuutissa saavutettiin 7 %. Vuodesta 12 minuutista 19 minuuttiin nopeus pidettiin 93 %:ssa liuotin A:ta ja 7 %:ssa liuotin B:tä. Tämän jälkeen nopeus muutettiin lähtöolosuhteisiin kolonnin tasapainottamiseksi 15 minuutiksi ennen kuin injektoitiin jälleen 10 μL seuraavaa näytettä.

3. Tulokset

3.1. Tulokset

3.1. Tulokset

3.2. Neutraloinnin analysointi määritellyssä väliaineessa

Minimisuolainen väliaine valittiin bakteerin tuottaman orgaanisen hapon analysointiin sen määritellyn luonteen ja juomateollisuuden jäteveden kaltaisen hiililähteen vuoksi. Bakteerin annettiin kasvaa minimaalisuolaisessa väliaineessa, jota täydennettiin eri hiililähteillä glukoosilla, fruktoosilla ja sakkaroosilla. Kuvassa 1 esitetään kasvuprofiili ja väliaineen pH-ominaisuudet ajan myötä. Fruktoosi ja sakkaroosi neutraloivat väliaineen paljon nopeammin kuin glukoosi. Glukoosilla saatu lopullinen pH oli myös hieman korkeampi kuin sakkaroosilla ja fruktoosilla täydennetyssä väliaineessa. Tämä näkyy myös kolmella hiililähteellä kasvatetun bakteerin kasvuprofiilissa. Bakteerit kasvoivat nopeammin sakkaroosilla ja sen jälkeen fruktoosilla ja glukoosilla.

(a)

(b)

(a)
(b)

Kuva 1

PH:n vaihtelu (a) ja O.D. (b) muuttuminen ajan funktiona mekaanisesti erotetussa liuosseoksessa. Arvot edustavat kolmen toistomittauksen keskiarvoa, ja virhepalkit edustavat keskihajontaa.

3.2. Viljelmän supernatantissa esiintyvän funktionaalisen ryhmän tunnistaminen

Bakteerin emäksisen jäteveden neutraloimiseksi tuottaman metaboliitin funktionaalisen laajan funktionaalisen ryhmän tunnistamiseksi pakastekuivatulle viljelmän supernatantille tehtiin FT-IR-spektroskopia. Spektrissä oli kaksi piikkiä, jotka vastasivat karbonyyliryhmää (1644,98 cm-1) ja hydroksyyliryhmää (3436,74 cm-1) (taulukko 1). Kirjallisuustutkimuksen mukaan bakteeri tuottaa todennäköisesti orgaanisia happoja aineenvaihduntatuotteena, joka neutraloi emäksistä jätevettä.

Huippujen lukumäärä Huipputyyppi Aalto numero (cm-1) Tulkinta 1 Major 3436.74 Hydroksyyliryhmä 2 Minor 2095.92 3 Major 1644.98 Karbonyyliryhmä 4 Minor 1167.97 5 Minor 1079.86

Taulukko 1

Kannan 12/1 kasvatusnesteen FT-IR-spektroskopian tulos.

3.3.3. TUTKIMUSTULOKSET. Bakteerin spesifisen aineenvaihduntatuotteen tunnistaminen

Bakteerin tuottaman orgaanisen hapon tunnistamiseksi suoritettiin käänteisfaasi-HPLC käyttäen tunnettuja orgaanisen hapon standardeja, jotka valittiin kirjallisuustutkimuksen perusteella. Standardit ajettiin sekä yksitellen (kuva 2 a) että seoksena (kuva 2 b)), jotta voitiin selvittää mahdolliset erot retentioajoissa, jotka johtuvat väliaineessa olevien muiden orgaanisten happojen aiheuttamista häiriöistä. Orgaanisten standardihappojen RT:n todettiin olevan molemmissa tapauksissa samanlainen, eikä retentioaikojen ero ylittänyt 0,09 yksikköä propionihappoa lukuun ottamatta (taulukko 2). Viljelmän supernatantti analysoitiin samalla menetelmällä, ja sen havaittiin koostuvan yhdestä piikistä, jonka retentioaika oli samanlainen kuin muurahaishapolla. Tämä vahvistettiin edelleen lisäämällä supernatanttiin vakiomuurahaishappoa, jonka piikki oli päällekkäinen supernatantissa olevan tuotteen piikin kanssa (kuva 2 d).

S. no. Organohappo RTa RTb RTa-RTb RTc 1 Formiinihappo 4.13 4.18 -0.05 2.56 2 Maitohappo 5.28 5.37 -0.09 3.57 3 Eetikkahappo 5.58 5.65 -0.07 3.76 4 Mustikkahappo 7.65 7.80 -0.13 5.68 5 Propionihappo 11.49 10.73 0.76 8.08 6 Isovoihappo 23.40 23.35 0.05 –

Taulukko 2

Organisten vakiohappojen pidättymisaika. RTa yksittäinen retentioaika, RTb retentioaika seoksessa. RTc Tormossa ja Izcossa ilmoitetut retentioajat .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Kuvio 2

RP-Yksittäisten orgaanisten standardihappojen HPLC-kromatogrammit (a), orgaaniset standardihapot seoksessa (b), viljelmän supernatantti (c) ja viljelmän supernatantti, johon on lisätty muurahaishappoa.

3.4. Bakteerin aineenvaihduntatuotteen kvantitatiivinen analyysi

Viljelysnesteen kvantitatiivista analyysia varten ajettiin erilaisia muurahaishapon standardikonsentraatioita ja laskettiin kutakin konsentraatiota vastaava piikin pinta-ala. Huipun pinta-ala piirrettiin konsentraation suhteen, jotta saatiin standardikäyrä (kuva 3). Tätä standardikäyrää käytettiin laskettaessa ajan myötä tuotetun hapon määrää minimaalisuolaisessa väliaineessa, jota täydennettiin eri hiililähteillä. Bakteeriviljelyn supernatantti analysoitiin ajasta riippuvalla tavalla ja sille tehtiin jälleen käänteisfaasi-HPLC-analyysi. Todettiin, että bakteeriviljelyn supernatantissa olevan päätuotteen piikki kasvaa ajan myötä. Hapon retentioaika on samanlainen kuin muurahaishapolla. Eri hiililähteillä tuotetun muurahaishapon tutkimus ajan funktiona on esitetty kuvassa 4. Eniten happoa tuotettiin sakkaroosilla täydennetyn mekaanisesti erotetun liuosseoksen tapauksessa, ja seuraavaksi eniten fruktoosia ja glukoosia.

Kuva 3

Vakiokäyrä muurahaishapon konsentraation määrittämiseksi kasvatusnesteessä.

Kuva 4

Tuotetun orgaanisen hapon määrän vaihtelu ajan funktiona MSM:llä, jota on täydennetty eri hiililähteillä. Arvot edustavat kolmen toistomittauksen keskiarvoa ja virhepalkit keskihajontaa.

4. Pohdinta

Juomateollisuuden jäteveden pääasiallinen hiililähde on sakkaroosi . Tämän vuoksi neutraloinnin aikana syntyvän aineenvaihduntatuotteen analysointia varten valittiin hyvin määritelty minimaalinen suolamedia, joka sisältää sakkaroosia ja kahta siihen sisältyvää monosakkaridisokeria – glukoosia ja fruktoosia. Kannan 12/1 kasvuominaisuudet minimaalisella suolamedia-aineella, jota on täydennetty näillä kolmella hiililähteellä, osoittavat tehokasta neutraloitumista samanaikaisesti kasvun kanssa (kuvat 1(a) ja 1(b)). Kasvualustan pH:n lasku johtuu välttämättä joko happojen muodostumisesta tai emästen poistumisesta .

Happojen muodostuminen on hyvin dokumentoitu yksinkertaisilla sokereilla kasvatettujen bakteerien tapauksessa. Joidenkin Bacillus-suvun alkalifiilisten jäsenten aineenvaihduntatuotteita on tutkittu . Sakkaroosin hiililähteellä tuotettu tärkein orgaaninen happo näissä tutkimuksissa oli etikkahappo. Alkalifiilisten bacilluslajien – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans ja Bacillus clausii – genomisekvenssit tukevat myös tätä havaintoa, sillä kaikilla näillä lajeilla on toimiva pyruvaatin ja asetaatin välinen muuntoreitti. Muurahaishappo on neutrofiilisten bakteerien yleinen metaboliitti anaerobisissa olosuhteissa, kun taas B. circulans var. alkalophilus tuottaa sitä jopa 2 g/l jopa aerobisissa viljelmissä. Muut haihtuvat hapot, kuten propioni-, voihappo-, isovoihappo- ja isovaleerihappo, ovat tyypillisiä kannoille Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus ja Bacillus sp. 17-1. Isovoihappoa ja isovaleerihappoa on raportoitu useiden neutrofiilisten bakteerien elatusaineissa. Näiden happojen sekä propioni- ja voihappojen katsotaan kuitenkin olevan peräisin aminohapoista Clostridium sp. -bakteerilla tehtyjen tutkimusten perusteella. Neutrofiiliset bakteerit tuottavat melko yleisesti maito- ja palsternakkahappoa, mutta Bacilluksen tuottama meripihkahappo on harvinaista. Etanolia ei ole havaittu alkalifiilisissä bakteereissa, vaikka se on tyypillinen tuote monien neutrofiilisten bakteerien glukoosiviljelmissä. Näin ollen emäksiset kasvuolosuhteet voivat vaikuttaa neutraalien aineenvaihduntatuotteiden tuotantoon .

Bacillus sp. -bakteerien aineenvaihduntatuotteiden ensimmäiset tutkimukset oli tehty titrimetristä menetelmää käyttäen . Bakteeriviljelyn supernatantin lisääntynyttä puskurikapasiteettia pH 5:n ympärillä, joka on tyypillinen karboksyylihappojen protonoitumisalue, käytettiin olettamukseen, että väliaine sisältää karboksyylihappoja. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet FT-IR-spektroskopiaa varmistaaksemme viljelmän supernatantissa olevan yhdisteen (yhdisteiden) funktionaalisen ryhmän. FT-IR-spektrografi osoitti karbonyyliryhmälle (1644,98 nm:ssä) ja hydroksyyliryhmälle (3436,74 nm:ssä) ominaisia piikkejä (taulukko 1), mikä viittaa hydroksyyli- ja karbonyyliryhmästä koostuvan kemiallisen lajin läsnäoloon, ja se on mitä todennäköisimmin karboksyylihappo.

Viljelyssä esiintyvien orgaanisten happojen analysoimiseen käytettiin käänteisfaasimenetelmää. HPLC-olosuhteet valittiin parhaan raportoidun erotuskyvyn mukaan, eli pH 2,2 ja 1 % asetonitriili. Käänteisfaasi-HPLC-menetelmä on edullinen, koska siinä käytetään edullisempia kolonneja, analyysiparametreja on helpompi säätää erottelun optimoimiseksi ja analyysit voidaan tehdä huoneenlämmössä . Menetelmää käytettiin ensin kirjallisuustutkimuksen perusteella valittujen happostandardien retentioaikojen laskemiseen. Happojen eluoitumisjärjestys näissä olosuhteissa oli sama kuin Tormon ja Izcon tutkimuksessa, mutta tässä tutkimuksessa havaituissa ja Tormon ja Izcon tutkimuksessa ilmoitetuissa retentioajoissa oli vaihtelua. Tämä vaihtelu voi johtua erilaisista HPLC-olosuhteista, kuten tässä tutkimuksessa käytetystä 25-30 °C:n lämpötilasta verrattuna Tormon ja Izcon ilmoittamaan 24 °C ± 1 °C:n lämpötilaan.

Viljelysnesteen RP-HPLC:ssä näkyi yksi piikki, jonka absorbanssi oli 211 nm:ssä, joka on orgaanisille hapoille ominainen absorption aallonpituus. Näin ollen supernatantti sisältää yhtä kemiallista lajia, joka on todennäköisesti orgaaninen happo. Tämän piikin retentioajan ja orgaanisten standardihappojen retentioajan vertailu osoittaa, että retentioaika muistuttaa eniten muurahaishappoa. Tämä havainto vahvistettiin edelleen lisäämällä muurahaishappoa viljelmän supernatanttiin, mikä kasvatti tuotteen piikin pinta-alaa (kuvat 2 c ja 2 d). Muurahaishapon esiintyminen viljelmän supernatantissa vastaa joidenkin Bacillus-suvun alkalifiilisten jäsenten sekä joidenkin sakkarolyyttisten anaerobisten alkalifiilisten bakteerien, kuten Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum ja Amphibacillus tropicus, aineenvaihduntatuotteita.

Tähän mennessä alkalifiilisillä bakteereilla raportoitu suurin pH-yksiköiden lasku aikayksikköä kohti on 0,13 yksikköä tunnissa Bacillus circulans var. alkalophilus -bakteerin tapauksessa, mikä on melko vähän verrattuna tässä tutkimuksessa raportoituun yli kahden yksikön laskuun ensimmäisen 1 tunnin inokulaation aikana. pH:n suuri lasku viittasi happamien kataboliatuotteiden muodostumiseen. Pelkkä pH:n alenemisnopeus ei kuitenkaan osoita happojen pitoisuuden kasvua. Siksi bakteerin aineenvaihduntatuotteiden kvantitatiivinen analyysi suoritettiin RP-HPLC:llä. HPLC:tä käytettiin mieluummin kuin GC:tä, koska GC- ja HPLC-menetelmien vertailu orgaanisten happojen määrityksessä alkalofiilisten bakteerien kasvatusnesteissä osoittaa, että vaikka happojen erottelukyky GLC:llä oli erinomainen, HPLC:n kvantitatiivinen toistettavuus oli parempi kuin GLC:llä . Tuotetun hapon pitoisuuden havaittiin odotetusti kasvavan inkubaatioajan pidentyessä (kuva 4). Itse asiassa hapon määrä jatkoi kasvuaan paljon sen jälkeen, kun pH:n minimi oli saavutettu. Tämä vastaa aiempia tutkimuksia happotuotannosta fakultatiivisten ja obligattien alkalifiilisten Bacillus sp. -bakteerien osalta, joissa happotuotanto jatkoi kasvuaan jopa 30 tuntia sen jälkeen, kun pH:n minimi oli saavutettu. Eri hiililähteillä täydennetyissä väliaineissa tuotetun aineenvaihduntatuotteen vertaileva analyysi osoittaa, että vaikka happoa esiintyi samassa loppupitoisuudessa, happotuotanto oli suurinta sakkaroosilla täydennetyssä väliaineessa, jota seurasivat fruktoosi ja glukoosi (kuva 4). Tämä on sopusoinnussa organismin kasvuominaisuuksien kanssa näillä sokereilla täydennetyissä väliaineissa.

5. Päätelmät

Exiguobacterium sp. kanta 12/1 neutraloi ulkoisen väliaineen pH:n tuottamalla lyhytketjuista orgaanista happoa – muurahaishappoa. Kun otetaan huomioon emäksisten jätevesien laajamittaisen bioremediaation potentiaalinen käyttömahdollisuus, tätä bakteerin alkalin neutralointikykyä juomateollisuuden jätevesien osalta voidaan pitää ensimmäisenä askeleena kohti sen kaupallistamispotentiaalin hyödyntämistä.

Kiitokset

N. M. Kulshreshtha kiittää University Grants Commissionia tutkimusapurahasta. Kirjoittajat ovat äärettömän kiitollisia Intian tieteellisen ja teollisen tutkimuksen neuvostolle T&K-alustan ja tilojen tarjoamisesta tätä tutkimusta varten.