ABSTRACT

Ennen ligointia jokainen eukaryooteissa jäljessä olevalle säikeelle syntetisoitu Okazaki-fragmentti on prosessoitava nukleolyyttisesti. Nukleaasihalkaisu tapahtuu DNA-polymeraasi-deltan suorittaman säikeensiirtymäsynteesin kautta syntyneiden 5′-läppärakenteiden yhteydessä. Ainakin kolme DNA-nukleaasia: Rad27:n (Fen1), Dna2:n ja Exo1:n on todettu osallistuvan Okazaki-fragmenttien läppien prosessointiin. Yksittäisten nukleaasien osuutta viivästyneiden säikeiden synteesissä tai niiden puuttuessa muodostuvien DNA-välikappaleiden rakennetta ei ole kuitenkaan selkeästi määritelty in vivo. Arvioimme systemaattisesti Rad27:n, Dna2:n ja Exo1:n vaikutusta lagging-strand-synteesiin vähentämällä ehdollisesti lagging-strand-nukleaaseja ja analysoimalla suoraan S. cerevisiae -bakteerissa in vivo syntetisoituja Okazaki-fragmentteja. Huomaamme, että Rad27 käsittelee suurimman osan lagging-juosteista, ja Exo1:llä on merkittävä lisäosuus, mutta ei Dna2:lla. Kun nukleaasin pilkkominen on heikentynyt, havaitsemme säikeen siirtymäsynteesin vähenevän eikä pitkien Okazaki-fragmenttien 5′-läppien laajalle levinnyttä syntymistä, kuten jotkut mallit ennustavat. Lisäksi osoitamme solusyklirajoitettujen konstruktioiden avulla, että sekä nukleolyyttinen prosessointi että Okazaki-fragmenttien ligatoituminen voidaan irrottaa DNA:n replikaatiosta ja viivästyttää vasta sen jälkeen, kun genomin suurimman osan synteesi on valmis.