Tulokset ja keskustelu

KSI:n erilaisten mutatoitujen mallisysteemien rakenteita ja energioita on tutkittu kolmessa reaktiovaiheessa: (ES → TS1 → EI1); toiseksi, protonoidun Asp-40:n lievä rotaatio (EI1 → TS2 → EI2); ja kolmanneksi, Asp-40:n protonin luovutus C6-β-asemaan (EI2 → TS3 → EP), kuten on esitetty kuvassa. 1. WT:n ennustettu energiaprofiili (kuva 2A) on samanlainen kuin Pollackin ja työtovereiden (25) vastaava kokeellinen profiili. On huomattava, että TS2:ssa substraatti on osittain neutraloitunut, kun katalyyttisten jäämien H-atomit lähestyvät substraatin oksyaanionia (O3) ja ylimääräinen elektroni siirtyy substraatista viereisiin katalyyttisiin jäämiin H-sidosten kautta. Näin ollen substraatilla, Tyr-16/57:llä ja Asp-103:lla on yksi yhteinen negatiivinen varausyksikkö, ja niiden varausjakaumat riippuvat mutanttien katalyyttisten jäännösten protoniaffiniteeteista ja elektroniaffiniteeteista. Tämä TS2-tila, jossa on katalyyttisiä jäännöksiä, eroaa tilasta, jossa ei ole katalyyttisiä jäännöksiä ja jossa substraatti on negatiivisesti varautunut lähes yhden yksikön verran.

Laskemamme EI:n kolmiulotteiset rakenteet (kompleksina ekvileniini steroidin sijasta) vastaavat lähes tarkalleen PI(g′):n ja TI(g′:n röntgenrakenteita.) Tyr-16/57 + Asp-103 + ekvileniini -kompleksin ennustetussa rakenteessa Tyr-16:n ja Asp-103:n kahden etäisyyden d(O3-Or)-arvot (2,54 ja 2,55 Å) ovat hyvässä yhteisymmärryksessä röntgensäteilytietojen kanssa (2,6 ± 0,1 Å molemmille PI:n tapauksessa ja 2,58 ± 0,08 Å:n ja 2,62 ± 0,07 Å:n TI:n tapauksessa) (32, 33, 36). Koska lasketut rakenteet optimoitiin ilman rajoitteita, kokeellisten ja teoreettisten geometrioiden yhteensopivuus osoittaa, että entsyymissä avainjäännöksillä on lähes maksimaalinen vuorovaikutus substraatin kanssa ilman rasitusta.

On arveltu, että liuoksessa TI:n aktiivisella kohdalla voi olla dyadinen rakenne (Asp-99… Tyr-14… ekvileniini) (29), joka poikkeaa TI:n ja PI:n röntgenrakenteista (32, 33). Hiljattain tehty PI/ekvileniinin NMR-koe on kuitenkin osoittanut, että PI(D40N)/ekvileniinille on ominainen voimakas alakentän resonanssi 16,8 ppm:n kohdalla ja heikko 13,1 ppm:n kohdalla (36), kuten Mildvanin (29) ja Pollackin (25) ryhmät ovat todenneet TI:n ja ekvileniinin tapauksessa. Tämä tulos käy ilmi myös Tyr-16/57 + Asp-103 + ekvileniinikompleksin ab initio -laskelmistamme, joissa vahva alaspäin suuntautuva resonanssi 16,5 ppm:ssä osoitetaan Tyr-16:lle. Kokeesta käy myös ilmi, että mutantissa D103L + D40N esiintyy voimakas down-field-resonanssi (osoitettu Tyr-16:lle), kun taas mutantissa Y16F + D40N voimakas resonanssi häviää. Näin ollen tämä koe sulkee selvästi pois dyadisen rakenteen, jossa vahva down-field-resonanssi osoitettiin Asp-103:lle, joka on H-sidoksissa Tyr-16:een (36).

Absoluuttisia nopeusvakioita voidaan tutkia laskettujen aktivointiesteiden avulla. B3LYP/6-31+G*- ja MP2/6-31+G*-tasoilla KSI:n WT:n aktivaatioeste on jonkin verran aliarvioitu verrattuna Pollackin ja työtovereiden (46) ilmoittamaan kokeelliseen esteeseen (10 – ≈11 kcal/mol). Kun kuitenkin otetaan huomioon KSI:n dielektrisen väliaineen vaikutus (31), WT:n aktivoitumiseste on 8,2 kcal/mol, mikä on lähellä kokeellista arvoa. Pieni aliarvio 2-3 kcal/mol voisi selittyä tarkemmalla laskennalla ja täydellisemmällä mallisysteemillä, joka sisältää apolaariset jäännökset aktiivisen keskuksen ympärillä. Toisin kuin absoluuttinen aktivaatioeste, eri mutanttien väliset suhteelliset aktivaatioesteet ja siten myös reaktiomekanismi ovat melko johdonmukaisia laskentatasosta riippumatta, koska samankaltaiset ympäristöt omaavien erilaisten mallijärjestelmien välillä on kumoava vaikutus. Käyttämällä eri mutanttien välisiä suhteellisia aktivaatioesteitä saimme siis suhteellisen reaktiivisuuden (mutantin kineettisen nopeusvakion suhde WT:n nopeusvakioon) tai log(kcat/kcat(WT)) olettaen, että siirtyminen ES:stä TS1:een on nopeutta määräävä vaihe reaktioreiteillä (ks. taulukon 1 alaviite). MP2-laskelmat vahvistavat B3LYP-tasolla saatuja tuloksia. Ennustetut log(kcat/kcat(WT))-arvot ovat hyvässä sopusoinnussa PI:lle (32-35) ja TI:lle (25-28, 31) mitattujen arvojen kanssa (taulukko 1). Koska TI:n erittäin homologinen kolmiulotteinen (tertiäärinen ja kvaternäärinen) rakenne ja aktiivisen alueen ympäristö ovat samankaltaisia kuin PI:n, näiden kahden KSI:n katalyyttisten reaktioiden odotetaan etenevän samalla tavalla.

Kuv. 2 esittää energioiden ja H-sidosten etäisyyksien profiilit eri mutanteille reaktiopolun varrella. Kokonaisenergiaprofiilit (ΔE) (kuva 2A) ovat lähes symmetrisiä TS2:n suhteen. Ensimmäisen ja kolmannen vaiheen esteet ovat samanlaiset. Toinen vaihe, jonka este on pieni (≈1 kcal/mol), ei voi olla nopeutta määräävä, koska siihen liittyy vain H-atomin vähäinen siirtyminen minimaalisen rotaation kautta (vain muutaman asteen verran, koska Asp-40 on voimakkaasti vinossa substraatin tasoa vastaan) C-C-sidoksen (tai C-H-sidoksen, kuvat 1 ja 3) ympäri. Näin ollen reaktiota voidaan käytännössä pitää kaksivaiheisena mekanismina. Jäännökset katalysoivat ensimmäistä vaihetta luovuttamalla (osittain) protonin substraatille (happona), kun taas kolmatta vaihetta katalysoi protonin (osittainen) hyväksyminen substraatilta (emäksenä). Katso H-sidosten hapenväliset etäisyydet ja jaetun protonin epäkeskinen etäisyys O3:n ja Or:n keskipisteestä, jossa positiivinen/negatiivinen arvo osoittaa, että protoni on lähellä jäännöstä/substraattia.

Hapoilla jäännöksillä, joilla on matalampi protoniaffiniteetti (pA kaasufaasissa tai pKa dielektrisessä väliaineessa), aktivaatioeste olisi matalampi ensimmäisellä askeleella ja korkeampi kolmannella askeleella, kun taas emäksisillä jäännöksillä, joilla on korkeammat pA:t tai korkeammat pKa:t, olisi päinvastainen vaikutus. Näin ollen kaksivaiheisessa entsyymimekanismissa optimaalinen katalyyttinen teho saavutetaan, kun entsyymin jäännöksillä on kaksoisrooli erittäin voimakkaana protonien luovuttajana/akseptoijana substraattiin/ substraatista vuorotellen (nimitetään amfihappo-/emäskatalyytiksi tai protoni-/elektronipuskuriksi) kokonaisreaktiossa. Entsyymien dielektrisessä väliaineessa maksimaalinen katalyyttinen vaikutus saavutetaan, jos jäännösten ja substraatin pKas-arvot ovat samat. Tämä tilanne on ristiriidassa yksivaiheisten reaktioiden kanssa, joissa suuri pKa-ero lisää reaktiivisuutta (47, 48). Maksimaalisen katalyyttisen vaikutuksen edellytys, jonka mukaan jäännösten ja substraatin pKas-arvot ovat yhtä suuret, vastaa vaatimusta, jonka mukaan entsyymin jäännösten ja substraatin pKas-arvojen on vastattava toisiaan maksimaalisen SSHB:n muodostamiseksi (4-7, 15, 23, 24). Näin ollen KSI:n kaksivaiheisessa reaktiomekanismissa SSHB:t amfihappo-/emäskatalyytteinä yhdessä osittaisten protonisukkuloiden ja varauksen uudelleenjakautumisen kanssa ovat ratkaisevassa roolissa EI:iden voimakkaassa stabiloinnissa ≈15 kcal/mol:n verran jäännöslähtöisessä stabilointienergiassa ja reaktiotiestä riippuvassa hapettimien välisten etäisyyksien lyhenemisessä suhteessa ES-olosuhteeseen .

Jäännösvetoinen stabiloitumisenergia ΔΔEa korreloi jossain määrin ΔdES:n kanssa, ellei protoninsiirto tapahdu jäännöksestä substraattiin (ts, ellei ΔrH ole negatiivisella alueella kuvassa 2C). Näin ollen stabiloituminen EI:ssä ja TS:ssä voidaan korreloida H-sidoksen etäisyyden lyhenemiseen ja siten H-sidoksen voimakkuuteen suhteessa ES-tilaan. Toisin sanoen normaalit (tai tavalliset) H-sidokset (neutraalien kumppaneiden välillä) ES-tilassa pyrkivät muuttumaan SSHB-sidoksiksi (joissa on mukana ionisia lajeja) EI- ja TS2-tiloissa. Näin ollen näiden lyhyiden sidosten pitäisi olla vastuussa osasta jäännösten aiheuttamasta energian alenemisesta. Protoninsiirron osalta potentiaali ES:n kohdalla on yksittäinen kuoppa kaikilla mutanteilla, kun taas potentiaalin muodolla (lähellä EI:tä tai TS:ää) alueella, jossa ΔrH on lähellä nollaa (eli TS1/EI1:n ympärillä c:n kohdalla ja EI1/TS2:n kohdalla e:n ja f:n kohdalla kuvassa 2C) on joitain kaksoiskuopan piirteitä. Pienellä ΔrH:n absoluuttisella arvolla (<≈0,5 Å) (kuva 2C) protoninsiirron esteen havaitaan laskelmissamme olevan hyvin pieni, joten protoninsiirrot kaksoiskaivon tyyppisessä potentiaalissa eivät yksinään voi selittää aktivaatioesteen jyrkkää alenemista. Tapauksessa g, jossa potentiaalin kaksoishuopatyyppiset ominaisuudet lähes häviävät, kun protoninsiirto on vähäistä, energia alenee enemmän kuin tapauksessa f, jossa protoninsiirto tapahtuu kaksoishuopatyyppisessä potentiaalissa. Toisaalta kuvissa 2 D ja E on huomattava, että protoninsiirtojen jälkeen ΔdES ei enää lyhene vaan hieman pitenee, kun taas ΔΔEa laskee edelleen. Näin ollen pelkkä H-sidosten pituuden lyheneminen (eli ΔdES) ei voi selittää rajujen esteiden alenemista TS:ssä ja EI:ssä (eli ΔΔEa). Näin ollen esteen aleneminen TS:ien ja EI:ien kohdalla on selitettävä ylimääräisillä vuorovaikutusvoimilla, joita käsitellään substraattien ja jäännösten välisten molekyyliorbitaalien (MO-vuorovaikutusten) kannalta (joihin liittyy varauksensiirron aiheuttamia elektronisia uudelleenjärjestelyjä tai varauksen uudelleenjakautumista).

Kahden kilpailevan jäännöksen tapauksessa, kuten f:ssä ja g:ssä, EI:ien/TS:ien kumulatiivinen stabiloituminen johtaa tehostuneempaan kcat-arvoon. Tämä vaikutus on kuitenkin jossain määrin subadditiivinen (ts. pienempi kuin kunkin jäännöksen stabiloitumisenergioiden summa), mikä johtuu siitä, että oksyanionin protoninvetovoima vähenee kunkin jäännöksen osalta toisen jäännöksen läsnäolon vuoksi. Tämä subadditiivisuus osoittaa, että SSHB:hen liittyy varauksensiirtoja ja polarisaatiota (eli indusoituja sähköstaattisia vuorovaikutuksia) ja mahdollisesti osittaista kovalenttista sidosta. EI:iden ja TS:ien stabiloituminen katalyyttisten jäännösten läsnä ollessa johtuu todellakin pääasiassa aktiivisessa keskuksessa olevan ylimääräisen elektronin delokalisaatiosta varauksensiirron ja polarisaation avulla, mikä nähdään jäljempänä. Substraatin tehokkaat luonnollisen sidoksen orbitaalipopulaatiovaraukset (49) tapauksissa a, c-e ja f TS1:ssä ovat vastaavasti -0,57, ≈-0,43 ja -0,37. Näin ollen substraatin negatiivinen varaus vähenee enemmän kahden katalyyttisen jäännöksen läsnä ollessa. Tämä vähennys johtuu ylimääräisen elektronin siirtymisestä substraatista katalyyttisiin jäämiin, joilla on suuri elektroniaffiniteetti ja jotka toimivat puskurina ylimääräiselle elektronille. Vaikka Aspilla on voimakkaampi elektroninvetokyky kuin Tyrillä, Tyrillä on pienempi elektroniaffiniteetti kuin Aspilla. Näin ollen Tyr on yhtä tehokas tai hieman tehokkaampi kuin Asp aktivoitumisesteen alentamisessa. TS:ien ja EI:ien stabiloituminen katalyyttisten jäännösten läsnä ollessa korreloi vahvasti ylimääräisen elektronin tilan energian alenemisen kanssa, koska ylimääräisen elektronin vastaanottamiseen tarvittava tila laajenee, kun katalyyttiset jäännökset ovat substraatin lisäksi mukana. Tämä energian aleneminen liittyy suoraan epävarmuusperiaatteeseen; mitä vähemmän ylimääräinen elektroni on paikallistettu, sitä enemmän se on stabiloitunut.

Laskettujen kemiallisten siirtymien (δ) havaitaan korreloivan jonkin verran d(O3-Or):n pienimmän arvon kanssa samalla H-sidosten lukumäärällä , kun taas toisen H-sidoksen läsnäolo kasvattaa δ:tä voimistuneen screening-vaikutuksen vuoksi. Tulostemme perusteella suuri δ:n arvo voi usein olla hyvä SSHB:n indikaattori, mutta δ korreloi vain osittain kcat:n kanssa. Tämä korrelaatio heikkenee erityisesti silloin, kun δ on suuri (>16 ppm) tai ΔrH:n absoluuttinen arvo on pieni (<0,5 Å), sillä kcat:n riippuvuus δ:stä on kyseenalaistettu (50).

Aktivoitumisesteiden aleneminen katalyyttisten jäännösten läsnä ollessa on hyvin ymmärrettävissä MO-analyysin perusteella (kuva 3). Silmiinpistävä ero TS2 MO-energiatasoissa a:n ja g:n välillä johtuu Asp-40:n deprotonoinnin kautta substraattiin kertyneen ylimääräisen elektronitiheyden kvanttiluonteesta. Saavutettu stabiloituminen, joka saavutetaan haihduttamalla osa elektronitiheydestä katalyyttisiin jäännöksiin, johtuu aiemmin mainitusta epävarmuusperiaatteesta, joka on samankaltainen kuin mitä on havaittu, kun ylimääräinen elektroni on vuorovaikutuksessa vesiklustereiden kanssa (51, 52), mikä puoltaa kohtuullisen suurta ontelotilaa. Näin ollen katalyyttisten jäännösten läsnäolo (joilla on varauksen puskurointitehtävä osittaisella elektroninsiirrolla substraatilta katalyyttisille jäännöksille) vähentää huomattavasti varauksen kertymistä oksianionille. Tätä EI:iden ja TS:iden stabilointia avustavat olennaisesti SSHB:t. Tämä vaikutus tehostuu huomattavasti sekä Asp-103:n että Tyr-16/57:n läsnä ollessa. Tapauksen g MO-energiat ovat siten paljon alhaisemmat kuin tapauksessa a. Entsyymin dielektrisen väliaineen vaikutus ei ole niin jyrkkä kuin katalyyttisen jäännöksen vaikutus, johon liittyy elektroninsiirto. Näin ollen SSHB:n edistämät osittaiset protonien sukkuloinnit ja varausten uudelleenjakautumiset ovat enemmän vastuussa TS:ien ja EI:ien alenemisesta kuin entsyymin dielektrinen vaikutus. Näin ollen katalyyttinen vaikutus johtuu ei-indusoitujen sähköstaattisten energioiden ja MO-vuorovaikutusenergioiden (polarisaatio, varauksensiirto ja kovalenttisen sidoksen energia) voittojen suotuisasta yhdistelmästä. Kun ensimmäinen johtuu osittaisesta protonin sukkuloinnista, joka johtuu varattujen H-sidosten läsnäolosta (ja liittyy siten SSHB:n vahvuuteen), jälkimmäinen johtuu pääasiassa elektronisesta delokalisaatiosta katalyyttisten jäännösten vuoksi, jotka toimivat puskurina ylimääräiselle elektronille. MO-vuorovaikutuksen energiavoitto liittyy läheisesti SSHB:n edistämään entsyymin ja substraatin väliseen lisävuorovaikutukseen.

Stabilisaatioenergia voidaan siten esittää EIs/TSs:n varautuneen H-sidoksen (jossa on mukana ionilajeja) lisääntyneen energian summana suhteessa ES:n normaaliin H-sidokseen (neutraalien kumppaneiden välillä) ja MO-vuorovaikutuksen energiavoiton summana, joka johtuu varauksen uudelleenjakautumisesta, johon liittyy elektronin dissipoituminen katalyyttisiin jäämiin. Koska nämä kaksi energiatermiä eivät ole helposti erotettavissa toisistaan, kumpaakin termiä on vaikea arvioida. Arvioimme kuitenkin tällaiset termit tapauksessa d käyttämällä seuraavaa menetelmää. Kun verrataan EI1:n energioita suhteessa ES:ään Tyr-16:n (Y16) puuttuessa ja läsnä ollessa, EI1:n stabiloitumisenergia Y16:n avulla on 8,7 kcal/mol. Tutkiaksemme ei-indusoidun sähköstaattisen vuorovaikutuksen (joka ei sisällä substraatin + Asp-40 (D40) sähköstaattista induktiovaikutusta residuaaliin Y16) osuutta stabilointiin, suoritimme ES:n ja EI1:n laskelmat siinä tapauksessa, että Y16 korvataan haamujäännöksellä, joka koostuu vain sen luonnollisen sidosorbitaalin (NBO) varauksista (Y16q), jotka laskettiin yhdelle molekyylille Y16 ilman substraattia + D40:tä. Tällöin ei-indusoitu sähköstaattisen vuorovaikutuksen energiavoitto (tai preorganisaatiosta johtuva sähköstaattinen energiavoitto) on 4,4 kcal/mol, joka on vastuussa varautuneen H-sidoksen (eli itse SSHB:n) lisääntyneestä sidoslujuudesta. Tällöin Y16:n aiheuttaman täyden kvanttivaikutuksen ja Y16q:n aiheuttamattoman sähköstaattisen vaikutuksen (4,3 kcal/mol) välisen stabiloitumisenergioiden eron pitäisi tulla indusoidusta sähköstaattisesta vuorovaikutusenergiasta, kovalenttisesta energiasta jne. Indusoitunut sähköstaattinen vuorovaikutus sisältää polarisaatio- ja varauksensiirtovaikutukset. Saadaksemme indusoidun sähköstaattisen energiavoiton saimme ensin Y16:n atomivaraukset (Y16qind), jotka sisältävät induktiovaikutuksen substraatin + D40 läsnä ollessa. Sitten suoritimme ES- ja EI1-laskelmat tapauksessa, jossa Y16 on korvattu haamujäännöksellä (Y16qind), joka koostuu vain sen atomipistevarauksista. Koska tämä stabiloitumisenergia on 8,2 kcal/mol, substraatin + D40:n ja Y16:n välisestä vuorovaikutuksesta indusoituva sähköstaattinen energiavoitto on 3,8 kcal/mol. Näin ollen varauksensiirron ja polarisaation aiheuttama energiavoitto on suuri ja verrattavissa ei-indusoituun sähköstaattiseen energiavoittoon. Jäännöksellä Y16 on tärkeä katalyyttinen rooli varauksen puskurina, joka vetää pois ja pitää suuren osan ylimääräisestä negatiivisesta varauksesta substraatissa sekä vastaavasta elektronisen varauksen uudelleenjaosta reaktion aikana. Tämä indusoitu sähköstaattinen energia syntyy MO-vuorovaikutusenergiasta katalyyttisen jäännöksen (Y16) ja substraatin + D40 välisen kvanttimekaanisen elektronisen varausvuorovaikutuksen avulla (eli SSHB-vetoinen substraatti-jäännösvuorovaikutusenergia). Lopulta jäljelle jäävä energiaosuus 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol voisi vastata enimmäkseen ei-elektrostaattista kovalenttista energiaa. Tämä energia on melko pieni, mitä vahvistaa myös MO-analyysimme, jonka mukaan ei-elektrostaattinen orbitaalien päällekkäisyys SSHB:ssä itsessään ei ole merkittävää.

Kaksivaiheiseen reaktiomekanismiin sisältyvissä entsyymeissä substraatti ei ole täysin negatiivisesti varautunut, vaan se on osittain anioninen, jolloin elektroni hajoaa katalyyttisiin jäämiin. Näin ollen tässä tapauksessa SSHB:n ajama stabiloitumisenergian lisäys (≈10 kcal/mol EI1:ssä) suhteessa normaaliin H-sidokseen ei osoittautuukaan pieneksi . Jos SSHB-energiaa laajennetaan siten, että se sisältää sekä substraatin että jäännöksen varauksen uudelleenjakautumisesta johtuvat substraatti-jäännöksen vuorovaikutukset, stabiloitumisenergia on preorganisaation aiheuttaman SSHB-energian ja SSHB:n aiheuttaman MO-vuorovaikutuksen energian summa. Jos kuitenkin otetaan huomioon vain itse SSHB:n vahvuus, sidosenergian lisäys pienenee huomattavasti (≈5 kcal/mol:iin).