6.2.3 Cowpea mosaic virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) on laajimmin tutkittu alusta erilaisille konjugaatioille ja bioteknologisille sovelluksille. Se on 30 nm:n kokoinen ikosaedrinen virus, ja se koostuu kaksiosaisesta positiivisenssisestä, yksisäikeisestä RNA-genomista, jossa kukin RNA-molekyyli on kapseloitu erilliseen partikkeliin. CPMV:n kapsidi koostuu 60 kopiosta kumpaakin kahdesta eri CP-alayksiköstä (pieni, 24 kDa, ja suuri, 42 kDa), joilla on pseudo T = 3 -ikosaedrinen symmetria. Koska kapsidin luonne on erittäin symmetrinen ja heteromeerinen, CPMV tarjoaa huomattavan mahdollisuuden ottaa käyttöön (viisinkertaisesti tai kolminkertaisesti tai molemmissa paikoissa) useita erilaisia toiminnallisuuksia spesifisellä geneettisellä ja kemiallisella insinööritieteellä, jolla voidaan kontrolloida sekä alueellista jakaumaa että moniarvoisuuden astetta (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV:tä voidaan puhdistaa suuria määriä tartunnan saaneista lehdistä, ja se on stabiili laajalla lämpötila-alueella (jopa 60 °C) ja pH-alueella 3,0-9,0 ja kestää joitakin orgaanisia liuottimia (Steinmetz et al., 2009). CPMV-kapsideja käytetään aktiivisten entsyymien hallittuun immobilisointiin. CPMV-kapsidien hyödyntäminen metallisten nanohiukkasten mallinnettuun valmistukseen sähköttömällä laskeutumisella (ELD) ja mineralisoinnilla erilaisilla prosesseilla mahdollisti ohuiden kerrosten tuottamisen metalleista ja metalliseoksista, joilla on yhtenäinen paksuus ja koostumus. CPMV-virioneja käytetään nanorakennuspalikoina 2D- ja 3D-rakenteiden hallittuun rakentamiseen käyttäen alhaalta ylöspäin suuntautuvaa, kerros kerrokselta kerrokselta (LbL) -lähestymistapaa potentiaalisia sovelluksia varten nanoelektroniikkalaitteina tai sähkökemiallisina moninkertaisina biosensoreina (tarkasteltu teoksessa Culver ym., 2015; Wen ym, 2015a, 2016; Narayanan ja Han, 2017a).

Natiiviset CPMV- ja lantanidimetallikomplekseilla johdetut CPMV-hiukkaset todettiin turvallisiksi ja myrkyttömiksi näiden hiukkasten biodistribuutio-, myrkyllisyys- ja patologiatutkimusten perusteella in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). CPMV:n havaittiin liittyvän tulehdusalueisiin ja aiheuttavan veri-aivoesteen häiriöitä keskushermoston (CNS) infektion aikana hiirissä (Shriver et al., 2009). CPMV, jonka pinta on PEGyloitu, on osoittanut vähäistä immunogeenisuutta, ja internalisaatio estyi useissa solutyypeissä epäspesifisen sitoutumisen vähenemisen vuoksi (Raja et al., 2003). Manchester ja työtoverit havaitsivat, että fluoresoivasti leimatulla CPMV:llä on endogeeninen kyky siirtyä verisuonten endoteelisoluihin, ja sitä voidaan käyttää intravitaalisena kuvantamisluotaimena, jolla voidaan visualisoida verisuonistoa ja verenkiertoa jopa 500 μm:n syvyydelle 72 tunnin ajan elävissä hiiren ja poikasen alkioissa (Lewis et al., 2006). CPMV:llä todettiin olevan luonnollinen kyky sitoutua pinnan vimentiiniin, sytoskelettiproteiiniin, joka moduloi solujen arkkitehtuuria ja dynamiikkaa, ja sen todettiin yliekspressoituvan endoteeli-, syöpä- ja tulehdussoluissa (Koudelka et al., 2009). CPMV:n bioyhteensopivuutta, luonnollista vuorovaikutusta vimentiinin kanssa ja endoteelia pidättäviä ominaisuuksia on hyödynnetty edelleen kasvainten angiogeneesin ja kasvainten kotiutumisen kuvaamiseen in vivo (Leong ym., 2010; Steinmetz ym., 2011; Yildiz ym., 2011; Wen ym., 2011), 2015a).

CPMV-kapsidin ulkopintaa on muokattu laajasti käyttämällä luonnossa esiintyviä tai geneettisesti muunnettuja altistuneita lysiini-, kysteiini-, tyrosiini- sekä asparagiini- ja glutamiinihappojäännöksiä käyttämällä tavanomaisia kemiallisia konjugaatiomenetelmiä ja konjugoivia ristisidosaineita useiden reagenssien, kuten Au-nanohiukkasten, kiinnittämiseksi, redox-reaktiivisia metyyliviologeniosuuksia, metalliorgaanisia ferroseenikarboksylaattiosuuksia, fluorofooreja, biotiinia, PEG-ketjuja, stilbeenijohdannaisia, hiilihydraatteja, heterologisia proteiineja (esim.g., ihmisen holotransferriini, T4-lyysotsyymi, internaliini B:n LRR-domeeni ja HER2-tyrosiinikinaasireseptorin Intron 8 -geenituote), vasta-aineet, oligonukleotidit, puolijohdekvanttipisteet ja fullereenit. Epäluonnollisten aminohappojen sisällyttäminen CPMV-kapsidiin toteutettiin useilla ortogonaalisilla kemiallisilla menetelmillä (kuten kemoselektiivinen hydratsoniligaatiostrategia ja kuparikatalysoitu atsidi-alkyyni-sykladition (CuAAC) tai ”klikkausreaktio”). Nämä ponnistelut ovat helpottaneet CPMV-hiukkasten käyttöä optisina koettimina, rokotekandidaatteina sekä muisti- ja anturinanolaitteina (katsaus Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso ja Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff ja Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan ja Han, 2017a). CPMV ja TMV ladattiin kuljettamaan kontrastiaineita kaksimodaalista magneettiresonanssikuvantamista (MR) ja optista kuvantamista varten, ja molemmat modaliteetit osoittivat fibriinin sitoutumisen spesifisyyttä in vitro kohdepeptidien läsnä ollessa. Prekliiniset tutkimukset kaulavaltimon tromboosin valokemiallisessa vaurioitumismallissa vahvistivat nanosondien trombien kotiutumisen, ja pitkulaisilla TMV-sauvoilla oli huomattavasti suurempi kiinnittyminen trombiin kuin ikosaedrisellä CPMV:llä (Wen ym., 2015b,c). E7p72-peptideillä (korkean affiniteetin epidermisen kasvutekijän kaltaista domeenia 7 (EGFL7) sitova peptidi, joka kohdistuu spesifisesti ihmisen endoteelisoluihin) koristellut CPMV:t kohdistuivat kasvaimiin liittyvään neovaskulaatioon suurella spesifisyydellä intravitaalikuvantamisella arvioituna (Cho ym., 2017).

CPMV:n kapsidien alayksiköiden in vitro- ja in vivo -kokoonpanon protokollia ei ole vielä vakiintunut hyvin. Tämä on rajoittanut sen käyttömahdollisuuksia nanokontaktorina rahtimolekyylien kapselointiin. CPMV-virionien natiivista nukleiinihappopitoisuutta käytettiin sähköstaattisena sienenä kuvantamisaineiden ja terapeuttisten molekyylien houkuttelemiseksi yksinkertaisella infuusiotekniikalla (Yildiz et al., 2013). CPMV:n esiasteen (VP60), joka koostuu fuusioituneista suurista ja pienistä proteiineista ja 24K-proteinaasista VP60:n proteolyyttistä prosessointia varten, transienttinen yhteisekspressio kasveissa johti CPMV:n VLP:iin (eCPMV), joissa ei ollut lainkaan RNA:ta (ei virusta eikä isäntää) (Saunders ym., 2009). Tällaisia tyhjiä kapsideita on käytetty kuljettamaan monenlaisia rahtimolekyylejä, kuten metalleja, fluoresoivia väriaineita tai lääkkeitä (Culver ym., 2015; Wen ym., 2015a; Narayanan ja Han, 2017a). Fluorofooreja, biotiiniaffiniteettimerkkejä, PEG:tä ja erilaisia peptidejä on saatu selektiivisesti näkyviin tyhjän CPMV:n sisäpinnalle kohdistamalla ne reaktiivisiin lysiineihin (Wen et al., 2012b). eCPMV:n tehokkuus in situ -rokotteena osoitettiin hiirimalleissa, joissa oli metastaattinen melanooma, rintasyöpä, munasarjasyöpä ja paksusuolen syöpä ja joissa se indusoi kasvaimen vastaisen immuunivasteen laukaisemalla neutrofiilien aktivaation ja infiltraation, mikä johti adaptiivisen immuniteetin aktivoitumiseen johtavaan kemo-/sytokiiniprofiiliin. Useimmat hiiret, joille annettiin uudelleen kasvaimia vastakkaisella kyljellä, hylkäsivät uudelleen annetut kasvaimet kokonaan (Lizotte ym., 2016). Magneettisen nanohiukkasen (mNP) intratumoraalinen annostelu hypertermian ja eCPMV:n indusoimiseksi yhdistelmänä paransi kasvaimen paikallista ja systeemistä hoitotehoa (sekundaarisen kasvaimen kasvun hidastuminen (abskopaalivaikutus) ja kasvaimen uudelleenhaastamisen vastustaminen) C3H-hiiren/MTG-B-maitorauhasen adenokarsinoomamallissa ja C57-B6-hiiren/B-16-F10- melanoomasyöpäsolumallissa (Hoopes et al., 2017a). Käyttämällä kahdeksaa spontaania koiran syöpää (kaksi suun melanoomaa, kolme suun amelioblastoomaa ja yksi karsinooma) Hoopes et al. (2017b) osoittivat, että hypofraktioidun säteilyn ja mNP:n aiheuttaman hypertermian ja intratumoraalisen eCPMV-hoidon yhdistelmällä saatiin aikaan tehostettuja immuunivasteita.

Käyttääkseen CPMV:tä lääkkeiden kohdennettuun toimittamiseen syöpäsoluihin ja CPMV:n ja nisäkässolujen luonnollisen vuorovaikutuksen voittamiseksi CPMV:n ja nisäkässolujen väliseen luonnolliseen vuorovaikutukseen käytettiin ”click”-reaktiota PEG:n ja folaattiligandiosan (CPMV-PEG-FA) konjugoimiseksi. Tämä konjugaatio mahdollisti CPMV:n spesifisen kohdentamisen folaattireseptoreita (FR) ilmentäviin HeLa- ja KB-soluihin (Destito ym., 2007). CPMV:n kohdentaminen neuroblastoomakasvainsoluihin saavutettiin muokkaamalla CPMV:tä geneettisesti siten, että siinä näkyi neuropeptidi Y:n (NPY) analogi kohdistusligandina. Osoitettiin, että CPMV-NPY vuorovaikutti spesifisesti SK-N-MC-solujen kanssa, jotka yliekspressoivat Y1-reseptoria (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Reseptorikohdistettu kuvantaminen saavutettiin ankkuroimalla CPMV:hen lyhyitä peptidisekvenssejä (verisuonten endoteelikasvutekijäreseptori-1:lle (VEGFR-1) spesifinen F56 ja vaskulaarisen endoteelin kasvutekijäreseptorille-1 (VEGFR-1) spesifinen bombesiini) ja gastriinia vapauttavan peptidin reseptoreille (GRPR) vastaavasti. Näiden CPMV-pohjaisten antureiden todettiin sitoutuvan spesifisesti syöpäsoluihin, jotka yliekspressoivat näitä reseptoreita solujen pinnalla (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen ja Steinmetz (2014) kehittivät alhaalta ylöspäin -lähestymistavan CPMV-nanohiukkasten, dimeerien ja kokoonpanojen synteesiin, jotka sisältävät kohdistusligandeja (syklisiä RGD-peptidejä) ja fluoresoivia väriaineita, ja havaitsivat, että RGD-peptidien symmetrinen esittäminen ja nanohiukkasten dimerisaatio lisäsivät syöpäsolujen kohdentamisen tehokkuutta.

CPMV:tä on menestyksekkäästi hyödynnetty useiden heterologisten epäsuorien epäsuorien peptidien esittelyyn immuunivasteiden aiheuttamiseksi. Eläinten immunisointi kullakin kimeeralla aiheutti voimakkaan humoraalisen immuunivasteen, joka suojasi kyseisen patogeenin aiheuttamalta haasteelta. Antiviraalisten molekyylien ja hiilihydraattien monivalenttinen näyttäminen CPMV:ssä helpotti niiden käyttöä terapeuttisiin sovelluksiin (Lomonossoff ja Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) vakiinnuttivat doxin kovalenttisen konjugaation CPMV:hen joko amidisidoksen tai disulfidisillan avulla käyttäen CPMV:n ulkopinnan lysiini- tai kysteiinijäämiä. Doksilla ladatulla CPMV:llä oli suurempi soluja tappava vaikutus kuin vapaalla doksilla jopa pienillä annoksilla. CPMV:tä, joka on muunnettu negatiivisesti varautuneista dendroneista koostuvalla koronalla, käytettiin positiivisesti varautuneiden fotosensitisaattoreiden lataamiseen (fotodynaamista hoitoa (PDT) varten). Tämä hybridi PDT-CPMV-kantajajärjestelmä tappoi tehokkaasti sekä melanoomasoluja että makrofageja in vitro (Wen et al., 2016). Kolmiarvoisen kromin (hyödyllinen kivennäisravinne) annosrajoittavien epäspesifisten myrkyllisyyksien voittamiseksi, sillä se voi selektiivisesti estää korkean glukoosipitoisuuden indusoimien ihmisen aortan sileiden lihassolujen (HASMC) proliferaatiota in vitro, Kromikloridia ladattiin CPMV:n sisäiseen onteloon infuusion avulla, ja näin saadut CrCl3:lla ladatut CPMV-hiukkaset (CPMV-Cr) vähensivät merkittävästi glukoosin indusoimaa HASMC:n proliferaatiota ja osoittivat antiaterogeenisiä vaikutuksia hyperglykeemisissä olosuhteissa (Ganguly ym.)., 2016).