Comparative genomics

Aluksi vertasimme 61 uruguaylaista isolaattia SNP-analyysin avulla P125109-genomiin vertailukohtana. Tämä analyysi osoitti, että kahdella vanhimmalla isolaatilla on yli 600 SNP:n ero referenssigenomiin verrattuna (607 SNP:tä 31/88 ja 652 SNP:tä 08/89), kun taas kaikilla muilla 59 isolaatilla on alle kaksisataa SNP:tä (60-166 SNP:tä) (lisätaulukko 1). Toisaalta kaikki uruguaylaiset genomit eroavat P125109-genomista 17 SNP:llä.

SNP:iin perustuva fylogeneettinen analyysi paljasti, että on olemassa kaksi kladeja, jotka nimesimme E1:ksi ja E2:ksi (kuva 1(b)) ja joihin kuuluu 57 kantaa 61:stä. Nämä 57 kantaa kuuluvat tärkeimpään S. enterica serovar Enteritidis MLST-sekvenssityyppiin 11 (ST-11), ja niitä on esiintynyt maassa vuodesta 1994 lähtien. Loput neljä isolaattia (31/88, 8/89, 77/02 ja 89/02) eivät kuuluneet mihinkään näistä kahdesta kladista (kuva 1 b). Olemme aiemmin raportoineet, että kaksi vanhinta isolaattia (31/88 ja 8/89) kuuluvat MLST-sekvenssityyppiin 1974 (ST1974) ja että ST1974 on peräisin ST11:stä sen jälkeen, kun sille ominainen profaagi on omaksuttu8. Kaksi muuta isolaattia, 77/02 ja 89/02, kuuluvat ST11:een kuten suurin osa kannoista.

E1-klaadi käsittää 21 kantaa, jotka kattavat kaikki viisi epidemiologista ajanjaksoa ja jotka on eristetty elintarvike-, eläin- tai ihmisinfektioista. Sen sijaan E2-klaasia edustaa 36 isolaattia, joista 34 eristettiin epidemioihin liittyvinä ajanjaksoina (kuva 1(a,b)). Näin ollen on perusteltua olettaa, että E2 voi muodostaa linjan, joka oli vastuussa S. enterica serovar Enteritidis -epidemioista maassa.

Aiemmin raportoimme 203 kannan fylogeneettisen analyysin, joka edustaa S. enterica serovar Enteritidis EBG4 -isolaattien sisäistä moninaisuutta eri puolilla maailmaa ja johon sisältyi kuusi tässä tutkimuksessa käytetyistä 61:stä uruguaylaisesta isolaatista8. Kuten nyt havaittiin, puolet näistä kuudesta kannasta on E1- ja puolet E2-kantoja (E1: 53/94, 206/99 ja 214/02; E2: 8/02, 251/01 ja 253/01), ja kumpikin näistä kahdesta ryhmästä on läheisessä sukulaisuussuhteessa Euroopasta ja Pohjois-Amerikasta peräisin oleviin kantoihin. Tämä sukulaisuus on esitetty täydentävässä kuvassa S1, joka sisältää aiemmin raportoidun fylogenian, jossa on suurennettu näiden kantojen muodostamaa kladeja. Tämä viittaa siihen, että E1:llä ja E2:lla voi olla laaja levikkikuvio.

Tukeaksemme tätä oletusta entisestään suoritimme uuden fylogeneettisen analyysin, tällä kertaa keskittyen alueella eristettyihin kantoihin, mukaan lukien 12 Argentiinasta, 122 Brasiliasta ja samat 61 genomia Uruguayssa (kuva 2(a)). Mielenkiintoista oli havaita, että kaikki nämä kannat ryhmittyivät hyvin samankaltaiseen klusteriin kuin mitä havaitsimme Uruguayn isolaateissa, eli E1-klusteri sisältää nyt kantoja Argentiinasta ja Brasiliasta, kun taas E2-klusteri sisältää kantoja Brasiliasta (103 E1:ssä ja 62 E2:ssa). Koska EnteroBase-tietokannassa on saatavilla vain vähän Argentiinasta peräisin olevia genomeja, emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että linja E2 on kiertänyt tässä maassa. Vain 30 kantaa kaikista kolmesta maasta ryhmittyi E1:n ja E2:n ulkopuolelle, joista 24 oli eristetty ennen vuotta 1994 (kuva 2(a), lisätaulukko 2). Kaiken kaikkiaan tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että E1- ja E2-kannat on tuotu alueelle vuoden 1994 tienoilla ja että ne ovat siitä lähtien kiertäneet Uruguayssa, Brasiliassa, Argentiinassa, Euroopassa ja Pohjois-Amerikassa, mikä tukee ajatusta siitä, että molemmat muodostavat Enteritidis-serovarin linjan.

(a) Fylogeneettinen puu 195 genomista, mukaan lukien 61 Uruguaysta (valkoiset lehdet), 12 Argentiinasta (vaaleansiniset lehdet) ja 122 Brasiliasta (keltaiset lehdet). E1-linjan oksat on väritetty sinisellä. E2-linjan oksat on merkitty punaisella. Oikeanpuoleiset kaistat kuvaavat eri väreillä ycdX:n, pduD:n, hsdM:n, ybiO:n, yiaN:n, aas:n ja aceA:n alleelivariantteja. Katso värilegendat b-kohdan sisällä. Mittakaavapalkki edustaa muutoksia muunnospaikkaa kohti. (b) YcdX:n, pduD:n, hsdM:n, ybiO:n, yiaN:n, aas:n ja aceA:n eri allelivarianttien geenikohdistukset. Geenit on kuvattu siten kuin ne on merkitty kunkin variantin sisältävässä genomissa, ja ne on kohdistettu viitteeseen P125109. Kohdistuksen mittakaava emäspareina (bp) on merkitty vaakapalkeilla. Kuhunkin varianttiin liittyvät SNP:t suhteessa vertailugenomiin esitetään yksityiskohtaisesti taulukossa 1. SNP:t, jotka aiheuttavat ei-synonyymisiä variantteja, on merkitty merkinnällä X → Y (yksikirjaimisella aminohappokoodilla) suhteessa sen sijaintiin geenissä. Synonyymiset SNP:t on merkitty vain suhteessa sen sijaintiin geenissä (syn SNP).

Toteutimme tämän jälkeen vertailevan genomianalyysin, jonka tarkoituksena oli tunnistaa geneettiset erot, jotka liittyvät linjoihin E1 ja E2, mukaan lukien 165 genomia: 57 Uruguaysta, 11 Argentiinasta ja 97 Brasiliasta (kuva 2(a)).

Alleliset variantit E1- ja E2-linjojen välillä

Koska emme löytäneet E1- ja E2-linjojen välisiä eroja liitännäisgenomissa, etsimme SNP-eroja 165 valitun kannan välillä. Tämä analyysi osoitti, että tärkeimmät erot E1:n ja E2:n välillä sijaitsevat kolmessa geenissä: ycdX, pduD ja hsdM. Nämä geenit ovat keskeytyneet E1-genomissa verrattuna vastaaviin geeneihin E2-genomissa. Lisäksi neljästä muusta geenistä, ybiO:sta, yiaN:stä, aasista ja aceA:sta, löytyi allelivariantteja, jotka ovat spesifisiä kummallekin linjalle (kuva 2(a,b); taulukko 1).

Kaikki 103 E1-kantaa (11 Argentiinasta, 71 Brasiliasta ja 21 Uruguaysta) osoittavat 4 emäsparin insertiota, joka sijaitsee geenissä ycdX (SEN1912) verrattuna referenssiin ja kaikkiin E2-kantoihin (taulukko 1). Tämä insertio aiheuttaa ennenaikaisen stop-kodonin, joka voi tuottaa pseudogeenin tai typistetyn version proteiinista (kuva 2(b) ja taulukko 1). YcdX-geeni koodaa hydrolaasia, joka kuuluu PHP-proteiinien superperheeseen, joka sisältää NH2-terminaalisen php-domeenin (polymeraasi-histidinolifosfataasi). Tämä domeeni on tyypillinen bakteerien DNA-polymeraasi III:n alfa-alayksikölle, ja se osallistuu oikolukutoimintoon22. On ehdotettu, että YcdX osallistuu E. coli -bakteerin DNA:n korjausreitteihin ja voisi toimia nukleaasina tai fosfataasina näissä reiteissä23. Wang et al. löysivät hiljattain kaksi tämän geenin alleelivarianttia (ei-synonyyminen SNP) S. enterica serovar Enteritidis -isolaattien välillä, joilla on selvästi erilaiset kyvyt selviytyä munanvalkuaisessa24. Inoue et al. osoittivat, että mutaatio ycdY:ssä (ycdWXYZ-operonin viereisessä geenissä) aiheutti E. coli -bakteerissa parveilun tukahduttamisen25.

Kaikkien E2-linjan kantojen pduD-geenin alleelivariantti on sama (SEN2039), kun taas 102:ssa 103:sta E1-linjan kannasta on emäksen vaihtuminen, joka tuo käyttöön pysäytyskoodonin, joka on samankaltainen kuin havaittu ycdX:n osalta (taulukko 1). Jäljelle jääneestä kannasta (eli uruguaylaisesta kannasta 11/07) puuttuu kokonaan pduD-geeni (kuva 2 b) ja taulukko 1). pduD koodaa propaanidioli-dehydraasia, joka on osa pdu-operonia, joka koodaa kaikkia 1,2-propaanidioli-kataboliassa tarvittavia proteiineja. Tämä operoni, joka on saatu salmonellan lateraalisen geenisiirron kautta26,27 , on häiriintynyt eri serovareissa, jotka aiheuttavat invasiivisia suoliston ulkopuolisia infektioita ihmisessä, kuten muun muassa Typhi ja Paratyphi A28. Faber et al. raportoivat, että tämän operonin toimivuus voi olla tärkeää kilpailussa suolistomikrobiston kanssa, sillä 1,2propaanidioli on anaerobisessa suolistoympäristössä aineenvaihduntatuote, jota salmonella voi käyttää, kun se kytketään tetrationaatin anaerobiseen hengitykseen29. On ehdotettu, että kyky käyttää 1,2propaanidiolia mahdollistaa patogeenipopulaation laajenemisen suolistossa lisäämällä erittymistä ulosteeseen, mikä on tärkeä tekijä epidemian leviämisessä29.

Lisäksi kaikilla E2-kannoilla on sama hsdM-geenin alleelivariantti (SEN4290), mutta E1-kannoilla on useita variantteja tämän geenin osalta (kuva 2(b) ja taulukko 1). Useimmissa E1-kannoissa on hsdM:n variantteja, jotka tuottavat joko typistetyn version (4 varianttia kuudesta) tai proteiinin ei-synonyymisen substituution. Vain kolmessa E1-kannassa (mukaan luettuna Uruguayn 44/07) on sama variantti kuin E2-kannassa, mikä viittaa siihen, että vain E1-kannoissa hsdM on altis kertymään mutaatioita (kuva 2 b)). hsdM-geeni koodaa DNA-metylaasia, joka osallistuu tyypin I restriktiomodifikaatiojärjestelmään (RM) enterobakteereissa30,31. Aiemmat raportit yhdistivät tyypin 2 restriktiomodifikaatiojärjestelmät Salmonellan patogeenisyyteen, mikä johtuu virulenssigeenien ilmentymiseen kohdistuvista epigeneettisistä vaikutuksista32. Silva et al. osoittivat, että RM-geenien mutaatiot aiheuttavat heikentyneen fenotyypin invasiivisen salmonelloosin hiirimallissa33. Tyypin 1 RM-järjestelmien on myös kuvattu osallistuvan Yersinia pseudotuberculosis -bakteerin patogeenisyyteen34.

Kun otetaan huomioon, että E2:lla, mutta ei E1:llä, on ehjiä kopioita ycdX:stä, pduD:stä ja hsdM:stä, ja kun otetaan huomioon, että näiden geenien on aiemmin todettu osallistuvan salmonellan patogeenisyyteen, voidaan päätellä, että näillä kolmella geenillä voi olla merkitystä E2-kantojen epidemian leviämisen kannalta. Etsimme myös alleelivariantteja globaalista fylogeniasta, joka edustaa serovarien sisäistä monimuotoisuutta (täydentävä kuva 1 ja viite 8), ja havaitsimme, että vallitseva alleeli on kaikissa tapauksissa E2-alleeli, kun taas häiriintyneet variantit ovat spesifisiä E1-geeneille (tietoja ei ole esitetty).

Kuten edellä mainittiin, löydettiin vielä neljä muuta geeniä ybiO, yiaN, aas ja aceA, joilla oli vähäisiä sekvenssieroja molempien linjojen välillä. Näissä neljässä geenissä esiintyy yksi ainoa variantti E2-kannoissa, kun taas E1-kannat ovat enimmäkseen identtisiä referenssikannan P125109 kanssa.

Kaikki E2-kannat esiintyvät ybiO-geenin (SEN0772) erityisellä alleelivariantilla, joka johtuu substituutiosta, joka tuottaa proteiiniin Gly(601)→Arg:n (kuva 2(a,b), taulukko 1). YbiO-geeni koodaa osmoottiseen sopeutumiseen osallistuvaa oletettua mekaanisesti herkkää kanavaproteiinia, joka aktivoituu E. coli -bakteerin hypo-osmoottisessa sokissa35. Aiemmin on raportoitu, että S. enterica serovar Enteritidis -isolaateissa on kaksi tämän geenin alleelivarianttia, joilla on erilainen kyky selviytyä munanvalkuaisessa24. YiaN:n (SEN3494) (L-dehydroaskorbaattikuljettajan suuri permeaasi-alayksikkö, oletettu kalvoproteiini) osalta kaikissa E2-genomeissa on sama alleeli, joka eroaa Gly(163)→Ala:n osalta E1:stä. Samoin kaikilla E2:lla on sama variantti aas- (2-asyyliglyserofosforietanoliamiiniasyltransferaasi/asyyli-ACP-syntetaasi, SEN2853) ja aceA (isositraattilyaasi, SEN3966) -geeneissä. E1:ssä useimmissa kannoissa aas-geeni on identtinen referenssigeenin kanssa, ja muutamissa kannoissa on joko ei-synonyyminen substituutio (5 kantaa) tai synonyyminen substituutio (1 kanta) (kuva 2(a), taulukko 1). Vastaavasti aceA-geeni on identtinen referenssin kanssa kaikissa E1-genomeissa yhtä lukuun ottamatta.

Yhteenvetona havaitsimme, että ybiO:n, yiaN:n, aas:n ja aceA:n E2-alleelit ovat spesifisiä tälle linjalle.