mecA-geenin PCR-testaus

MecA-geenin sisällä on 188-bp:n pituinen fragmentti ja 178-bp:n pituinen fragmentti S. aureus-spesifinen Sa442-geeni monistettiin isolaateista 1 ja 2 erillisissä reaktioissa LightCycler-laitteella (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa) käyttäen SYBR-vihreää ja alukkeita Mec-S ja Mec-A tai Sa442-F ja Sa442-RS, kuten aiemmin on kuvattu (5). mecA-positiivisten isolaattien SYBR-vihreän sulamislämpötila on 79 °C. Sa442-positiivisten isolaattien SYBR-vihreän sulamislämpötila on myös 79 °C. S. aureus ATCC 29213 (oksasilliinille herkkä) ja S. aureus ATCC 43300 (oksasilliinille resistentti) käytettiin Sa442-geenin kontrolleina ja mecA-geenin negatiivisena ja positiivisena kontrollina. Toisin kuin kontrolleissa, isolaateista 1 ja 2 ei saatu mecA- tai Sa442-tuotetta. MecA-geenin suuremman 533-bp:n pätkän havaitsemiseksi tehtiin ylimääräinen PCR (4). Tuotetta ei syntynyt isolaateista 1 ja 2 eikä S. aureus ATCC 29213:sta, mutta odotetun kokoinen tuote syntyi S. aureus ATCC 43300:sta. Positiivisena kontrollina käytetty 16S rRNA -geeni monistui kaikista kannoista (tietoja ei ole esitetty).

S. aureuksen metisilliiniresistenssin tarkka ja oikea-aikainen toteaminen on kliinisen mikrobiologian laboratorion tärkeä tehtävä (20). Vaikka mecA-geenin osoittaminen PCR:llä on kultainen standardi, PBP2a-lateksiagglutinaatiotesti on osoittautunut yksinkertaiseksi ja nopeaksi testiksi, jolla on hyvät suorituskykyominaisuudet metisilliiniresistenssin osoittamiseksi sekä S. aureuksessa että koagulaasinegatiivisissa stafylokokkilajeissa huolimatta siitä, että joissakin tapauksissa on tarpeen suorittaa edeltävä induktio (1, 21). PBP2a-määrityksessä käytetään lateksihiukkasia, jotka on herkistetty PBP2a:ta vastaan kasvatetuilla monoklonaalisilla vasta-aineilla (11). Tämän testin spesifisyys lähestyy tiettävästi 100 prosenttia (18, 19). Vaikka PBP2a-lateksiagglutinaatiotestien suorituskyvystä S. intermedius -isolaateille ei ole raportteja, vääriä positiivisia PBP2a-tuloksia on havaittu kahdella S. warneri -isolaatilla, joista toinen tehtiin 1 minuutissa ja toinen 6 minuutissa ja jotka molemmat olivat mecA PCR-negatiivisia ja joiden oksasilliinin MIC-arvo oli ≤0,5 μg/ml (21). Valmistajan pakkausselosteen mukaan vääriä positiivisia reaktioita ovat yleensä heikot agglutinaatiot, jotka ovat usein negatiivisia uusintatestauksessa tuoreella viljelyllä. Havaitsimme kuitenkin, että kaksi isolaattia oli toistuvasti positiivisia useiden viljelmien jälkeen, ja toinen oli vahvasti positiivinen. S. intermedius ATCC 29663 -kanta oli itse asiassa negatiivinen PBP2a-testissä, mutta se poikkesi fenotyyppisesti kahdesta kliinisestä kannasta myös positiivisen mannitolikäymisen, β-laktamaasinegatiivisuuden ja penisilliiniherkkyyden osalta (tuloksia ei ole esitetty).

Koagulaasipositiivisuutta käytetään yleisesti osoittamaan kliinistä merkitystä ja patogeenisuutta Staphylococcus spp. isolaateille. S. aureus on yleisin kliinisessä laboratoriossa eristetty koagulaasipositiivinen stafylokokki, mutta myös S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae ja jotkin S. hyicus -kannat ovat koagulaasipositiivisia (1). Koagulaasipositiivisten stafylokokkien tunnistamiseksi laboratoriot käyttävät usein testien yhdistelmää vapaan koagulaasin tai hyytymistekijän havaitsemiseksi proteiini A:n kanssa ja ilman sitä. S. intermedius -isolaatit ovat positiivisia vapaan koagulaasin suhteen, mutta negatiivisia proteiini A:n suhteen, ja 14 prosentilla isolaateista on hyytymistekijä, mikä selittäisi positiivisen liukukoagulaasin ja heikon positiivisen BACTi Staph -lateksin isolaatin 1 osalta (6). Kuten aiemmin on kuvattu, havaitsimme pyrrolidonyyliaryyliamidaasipositiivisuuden olevan nopea tapa todeta, että koagulaasipositiivinen stafylokokki ei ole S. aureus (10). Uskomme, että tapauksemme viittaavat siihen, että S. intermedius -bakteerin todellinen esiintyvyys ihmisten haavainfektioissa on todennäköisesti aliarvioitu, koska kaikki koagulaasipositiiviset stafylokokit luokitellaan usein S. aureukseksi (17). Koska S. intermedius -bakteeria ei voida lopullisesti tunnistaa fenotyyppisin tai biokemiallisin menetelmin, 16S rRNA -geenin sekvensointi on osoittautunut hyödylliseksi Staphylococcus- ja Macrococcus-lajien taksonomisessa luokittelussa (8).

Ensimmäisessä, vuonna 1989 tehdyssä tutkimuksessa kävi ilmi, että 72 prosenttia koirien ientä ja koirien aiheuttamia haavainfektioita sairastavista S. intermedius -isolaateista oli alttiita penisilliinille eikä yksikään niistä ollut vastustuskykyinen oksacilliinille (16). Tuoreempi tutkimus osoitti, että oksasilliiniresistenssi on kasvava ongelma S. intermedius -isolaateissa, ja koirien nenästä, silmistä ja paiseista peräisin olevien isolaattien oksasilliiniresistenssiluvut olivat 60-85 prosenttia suuremmat kuin muista paikoista peräisin olevien isolaattien (7). Ensimmäisessä metisilliinille resistentin S. intermedius -bakteerin aiheuttamassa ihmisinfektiossa, jossa se oli keuhkokuumeen aiheuttaja, oksasilliinin MIC-arvo oli 32 μg/ml (3). Molemmat isolaattimme olivat resistenttejä penisilliinille ja β-laktamaasipositiivisia; näiden isolaattien oksasilliinin MIC-arvo oli 0,125 μg/ml. Näiden isolaattien penisilliiniresistenssi, vaikka oksasilliiniresistenssi ei ollut negatiivinen mecA PCR:n perusteella ja koska ne eivät olleet alttiita β-laktaami/β-laktamaasi-inhibiittoriyhdistelmille, voidaan selittää β-laktamaasimäärityksen positiivisella tuloksella. Käyttämällä mecA-geenin 533-bp:n fragmenttiin kohdistuvaa alukesarjaa Gortel ym. vahvistivat, että mecA-geeni antaa metisilliiniresistenssin koirista eristetyille stafylokokeille (4). Nämä tutkijat havaitsivat, että kymmenestä koagulaasipositiivisesta stafylokokkikannasta, joilla oli mecA, yhdeksän oli S. aureusta ja yksi S. intermedius. He olettivat, että metisilliiniresistenssin esiintyvyyden ero S. intermedius -lajin ja S. aureus -lajin välillä johtui erosta lajien välisessä mecA-säätelyssä tai siitä, että S. intermedius -lajiin ei kohdistu voimakasta antibioottivalintapainetta (4). Vaikka muille koagulaasipositiivisille stafylokokeille kuin S. aureukselle ei ole olemassa erityisiä NCCLS:n tulkintaperusteita, fenotyyppisillä ja genotyyppisillä menetelmillä (mecA-geenin PCR käyttäen kahta alukesarjaa, jotka kohdistuvat 188- ja 533-bp:n fragmentteihin) tehtyjen oksasilliiniherkkyystestien tulokset yhdistettyinä alhaisiin oksasilliinin MIC-arvoihin verrattuna niihin, jotka on aiemmin raportoitu oksasilliinille resistentistä S. intermedius -bakteerista. intermedius -isolaatteihin verrattuna (MIC > 4 μg/ml), osoittaa tämän tutkimuksen isolaatit 1 ja 2 oksasilliinille herkiksi (3, 4).

On yleisesti hyväksytty, että S. aureuksen metisilliiniresistenssi johtuu pääasiassa ylimääräisen penisilliiniä sitovan proteiinin, PBP2a:n, hankkimisesta, jota mecA-geeni koodaa. MecA-geenin alkuperän etsintä johti mahdollisen evolutiivisen esiasteen löytämiseen S. sciurista, joka on eläinten yhteiseläin. S. sciurin mecA-homologilla oli 79,5 prosentin DNA-sekvenssin samankaltaisuus S. aureuksen mecA-geenin kanssa ja 88 prosentin aminohappoidentiteetti PBP2a:n kanssa. S. sciurin mecA-homologi ei aiheuta metisilliiniresistenssiä luonnossa. Couto et. al. kuitenkin tunnistivat ihmisistä peräisin olevia metisilliinille resistenttejä S. sciuri -isolaatteja, joissa mecA-homologin yliekspressio, joka oli seurausta IS256-elementin insertoinnista rakennegeenin ylävirtaan tai yhden nukleotidin muutoksista promoottorialueella, johti PBP2a:ta toiminnallisesti muistuttavan proteiinin tuotantoon (2). Samoin kuin S. sciuri -isolaatit, tässä kuvatut S. intermedius -isolaatit saattavat sisältää mecA-homologin, joka koodaa PBP2a-proteiinin kaltaista proteiinia, joka reagoi ristiin PBP2a:n kanssa lateksiagglutinaatiotestissä, mutta ei anna metisilliiniresistenssiä. Antigeeninen jäljittely täysin vieraan proteiinin kanssa on myös mahdollista. Kummassakin tapauksessa toivomme lisäävämme mikrobiologisen yhteisön tietoisuutta siitä, että on olemassa kliinisiä isolaatteja, jotka voivat kyseenalaistaa PBP2a-lateksiagglutinaatiotestin spesifisyyden.

Johtopäätöksenä esitämme ensimmäisen raportin väärästä positiivisesta PBP2a-tuloksesta kahdessa S. intermedius -lajin kannassa, jotka yhdistettynä fenotyyppisten testien alustavaan tulkintavirheeseen johtivat virheelliseen MRSA:ksi tunnistamiseen. Väärät positiiviset PBP2a-tulokset voivat johtaa virheellisiin infektioiden torjuntayrityksiin, vankomysiinin kaltaisten antibioottien tarpeettomaan käyttöön ja sairaalakustannusten yleiseen kasvuun (20). Nämä tapaukset korostavat, että on tärkeää seurata aktiivisesti poikkeavia laboratoriotutkimustuloksia raportointivirheiden välttämiseksi. Koagulaasipositiivisten stafylokokkien tarkka lajintunnistus on välttämätöntä kliinisten isolaattien patogeenisuuden, kliinisen merkityksen, herkkyysmallien ja epidemiologian määrittämiseksi.