Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden keruu

Osallistujat, jotka olivat 18-vuotiaita tai sitä vanhempia, kutsuttiin osallistumaan tutkimukseen sähköposti-ilmoituksilla ja ilmoitustauluille laitetuilla mainoksilla British Columbian yliopistossa Vancouverissa. Osallistujia pyydettiin toimittamaan näytteet käyttäen kuivalukkoisia bukkaalipyyhkeitä (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) ja sienikärkisiä bukkaalipyyhkeitä (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) käyttäen itseohjautuvia ohjeita; näytteiden antamisjärjestys satunnaistettiin tietokoneella. Tutkimusavustaja oli läsnä näytteenoton aikana vastatakseen kysymyksiin, joita osallistujilla oli näytteenotto-ohjeista. Kaikki näytteet säilytettiin huoneenlämmössä. Farmakogeneettisiä raportteja ei annettu osallistujille, koska se ei kuulunut tämän tutkimuksen piiriin.

DNA:n uuttaminen

DNA uutettiin Ambion MagMAX bead-based DNA extraction kitillä (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA uutettiin 3 päivää näytteenoton jälkeen ja eluoitiin 60 µl:ssa. DNA:n määrä ja laatu arvioitiin Qubit 2.0 -fluoresenssimäärityksellä (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Näytteiden puhtaus määritettiin optisen tiheyden A260/280 (ODA260/280) arvojen perusteella NanoVue-spektrofotometrillä.

Genotyypin määritys

Genotyypin määritys suoritettiin kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktion (qPCR) QuantStudio 12K Flex -laitteistolla (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) valmistajan validoimilla määritystavoilla (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Määritysten sisältö sisälsi 28 lääkevasteeseen vaikuttavaa SNP:tä OpenArray-alustalla (ks. lisätiedosto 2) ja CYP2D6 CNV TaqMan -määrityksen (Assay ID: Hs_00010001_cn). Määritysten validoimiseksi genotyypit määritettiin 44 DNA-kontrollitutkimuksella National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository at the Coriell Institute for Medical Research. Kutsujen vastaavuus vahvistettiin odotetun genotyypin kanssa. Lisäksi kontrolli-DNA:n Sanger-sekvensointi varmisti tulokset. Jokaista ajoa varten osallistujien näytteet ajettiin kaksoiskappaleina OpenArray-testissä ja neloiskappaleina CNV-määrityksessä yhdessä Corriellin DNA-näytteiden kanssa, joita käytettiin positiivisina kontrolleina ja ei-templaattikontrolleina (No Template Controls, NTC).

Statistinen analyysi

OpenArray-testin SNP-genotyypin määritysprosentti määritettiin TaqMan Genotyper -ohjelmistolla 1.3.1 (Applied Biosystems). Genotyyppisoittoprosentti laskettiin kullekin OpenArray-määritykselle jakamalla onnistuneesti määritettyjen genotyyppien kokonaismäärä yritettyjen genotyypin määritysten kokonaismäärällä.

CYP2D6-kopiolukumäärän määritykseen ja CNV-luottamuspisteiden määritykseen käytettiin CYP2D6-kopiolukumääräsoittojen ja CNV-luottamuspisteiden määritykseen CopyCaller v2.1 -ohjelmistoa (Applied Biosystems, Foster City, CA). DNA-näytteille määritettiin villin tyypin diploidinen kopioluku ja kopiolukuvaihtelut (deleetio- tai duplikaatiotapahtumat) ryhmiteltiin vastaavasti 2N- ja CNV-ryhmiin. SNP- ja CNV-genotyypin määritystuloksille asetettiin 95 prosentin genotyypin määritysprosentti ja 95 prosentin luottamuspisteet. Kahden otoksen Studentin t-testi, jossa oletettiin epätasa-arvoiset varianssit, laskettiin sen määrittämiseksi, oliko eri DNA-tyyppien DNA:n saannon, puhtauden ja kutsunopeuksien välillä merkittävä ero pareittain. Saman osallistujan samasta DNA-näytetyypistä (sienipintainen vs. kuivalukittu) tuotettuja genotyypin määrityksiä verrattiin konkordanssin laskemiseksi.

Tulokset

Rekrytoitiin 31 osallistujaa, jotka keräsivät sienipintaisia pyyhkäisynäytteitä ja kuivalukittuja pyyhkäisynäytteitä. Osallistujat pitivät itseopastettuja keräysohjeita suoraviivaisina ja helposti noudatettavina molempien pyyhkäisytyyppien osalta. Osallistujat toivat esiin kysymyksiä, jotka koskivat tarvittavaa painetta pyyhkäisysuikaleiden hankaamiseen ja pyyhkäisysuikaleiden oikeaa sijoittamista suuhun. Osallistujien kommentit näistä kahdesta pyyhkäisypuikosta olivat samankaltaisia, ja jotkut pitivät sienellä varustettuja pyyhkäisypuikkoja parempina ja toiset taas kuivia pyyhkäisypuikkoja parempina; mielipiteistä ei päästy yksimielisyyteen.

Kuivilla pyyhkäisypuikoilla kerätyn DNA:n keskimääräisessä DNA:n saannissa oli merkitsevä ero kuivilla pyyhkäisypuikoilla kerätyn DNA:n saannissa verrattuna sienellä varustettuihin pyyhkäisypuikoihin kerätyn DNA:n saantoon (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg, p = 4,4 × 10-7; taulukko 1). Kaikkien keruutyyppien keskimääräinen DNA-puhtaus oli hyväksytyllä alueella, kun puhtaan DNA:n keskiarvo (SD) oli 1,72 (0,78) kuivien pyyhkäisypyyhkeiden osalta ja 1,85 (0,39) sienipintaisten pyyhkäisypyyhkeiden osalta. Näillä kolmella näytteellä oli 100 %:n genotyypin määritysprosentti OpenArray-testissä ja 100 %:n CNV-luottamuspisteet (Kuva 1). Sitä vastoin yhdessä näytteessä, jonka DNA-pitoisuus oli 79 ng/µl, oli alhaisin OpenArray-kutsuprosentti (18 %). Korkeimmat OpenArray-tunnistusprosentit (> 95 %) havaittiin kuivasuljetuissa pyyhkäisynäytteissä seitsemässä näytteessä, joiden pitoisuudet vaihtelivat 1,2 ja 8,9 ng/µl välillä (kuva 1a). Korkeimmat CNV-luottamuskutsut (> 95 %) havaittiin näytteissä, joiden pitoisuudet vaihtelivat välillä 1,0-24,4 ng/µl (kuva 1b).

Kaikkien OpenArray:n määritysten osalta, sienipintaisista pyyhkäisynäytteistä kerätyistä DNA-näytteistä saatiin yleisesti ottaen korkeampi genotyypin määritysprosentti (97 %) kuin kuivapintaisista pyyhkäisynäytteistä kerätyistä DNA-näytteistä (54 %) (Kuva. 2). Kun lisättiin vaihe, jossa uutettua DNA:ta laimennettiin 0,5-kertaisella laimennoksella, sienestä otettujen pyyhkäisypyyhkeiden genotyypin määritysprosentti oli tasaisesti > 95 %. OpenArray-testissä näytteen tunnistustiheys vaihteli yksilöittäin, sillä 29 (93,5 %) osallistujalla näytteen tunnistustiheys oli > 95 % sienipintaisen pyyhkäisynäytteen DNA:sta ja 4 (12,9 %) osallistujalla näytteen tunnistustiheys oli > 95 % kuivasta ja lukitusta pyyhkäisynäytteestä saadusta DNA:sta. Samasta henkilöstä kerättyjen sienipintaisten pyyhkäisynäytteiden ja kuivalukkoisten pyyhkäisynäytteiden välillä havaittiin 94 %:n yhteneväisyys onnistuneesti genotyypitetyissä määrityksissä.

Kopionumerokutsut CYP2D6:lle määritettiin 2(6,5 %) näytteestä, jotka otettiin sienellä otetuista pyyhkäisynäytteistä, ja niiden luottamusluvun keskiarvoksi saatiin yhteensä 0,99. Vertailun vuoksi 8(25,8 %) näytteistä, jotka oli otettu kuivapintaisista pyyhkäisynäytteistä, saatiin kopionumerokutsut, joiden yleinen luotettavuuspistemäärä oli 0,91 (ks. lisätiedosto 3).

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tarkoituksena on auttaa tutkijoita ja yrityksiä yksilöimään optimaalinen keräysmenetelmä, jonka avulla saadaan laadukasta DNA:ta genotyypitystä varten. Tämä tutkimus tarjoaa uutta tietoa kahdenlaisten pyyhkäisynäytteiden DNA-laadusta, joka oli korkea (määritelty ODA260/A280 1,8), vaikka DNA:n saannissa oli merkittävä ero (p-arvo = 4,4-7). OpenArray-alustalla sienestä otetuilla pyyhkäisynäytteillä oli korkein yleinen genotyypin määritysprosentti (97 % vs. 54 %) ja korkein luotettavuusaste CYP2D6 CNV TaqMan Assay -testissä (0,99 vs. 0,91). > 95 %:n SNP-genotyypin määritysprosentin katsotaan kuvastavan hyväksyttävän laadukasta tietoa, ja 99 %:n CNV-luottamuspistemäärää pidetään korkealaatuisena .

Yhden sienipintaisesta pyyhkäisynäytteestä eristetyn DNA-näytteen määritysprosentti oli alle 95 %. Rutiininomaisessa laboratoriokäytännössä näytteet, joiden soittoprosentti on alhainen, kerättäisiin pois puutteellisten tulosten vuoksi potilasraportteja varten. Tämän näytteen poisjättäminen nosti genotyypinmäärityksen kokonaismääritysprosentin 99,5 %:iin sienipintaisilla pyyhkäisynäytteillä.

CYP2D6 CNV -tulokset osoittivat, että kuivasuljetuista pyyhkäisynäytteistä kerätyn DNA:n CNV-luokitusten määrä oli lisääntynyt 8(25,8 %) verrattuna sienipintaisiin pyyhkäisynäytteisiin, joita oli 2(6,5 %). Suurempi CNV-tunnusten määrä korreloi alhaisempien luottamuspisteiden kanssa. Suurin osa osallistujista 30(97 %) pystyi keräämään näytteitä, joiden genotyypin määritysprosentti oli korkea sienipintaisen pyyhkäisyn osalta, kun taas vain muutama henkilö 4(13 %) pystyi keräämään näytteitä, joiden määritysprosentti oli korkea molempien pyyhkäisytyyppien osalta. Johtopäätöksenä voidaan todeta, että potilaat hyväksyivät sienipintaiset pyyhkäisypyyhkeet ja että niistä saatiin hyvälaatuista DNA:ta, jonka saanto oli riittävä qPCR-pohjaista farmakogeneettistä testausta varten.