Aminoglycosides: Perspectives on Mechanisms of Action and Resistance and Strategies to Counter Resistance
STRUCTURAL BASES FOR MECHANISM OF ACTION
Escherichia coli -bakteerin 16S rRNA:ta on tutkittu hyvin rRNA-alayksiköistä, ja erityisesti erilaisten aminoglykosidi-antibioottien vuorovaikutusta 16S rRNA:n kanssa ja niiden vaikutuksia mRNA:n translaatioprosessiin, jossa mRNA:n translaatio muuttuu polypeptidiksi, on tutkittu tarkasti (35). Samanlaisia rRNA-rakenteita on myös muissa organismeissa, kuten hiivassa ja Tetrahymenassa (33). RRNA:n käsittely aminoglykosidilla suojaa useita rRNA:n nukleiinisia emäksiä kemialliselta muokkaukselta, mikä viittaa siihen, että näillä molekyyleillä on suuri affiniteetti tiettyihin kohtiin rRNA:ssa. Noller (35) vertasi tätä sitoutumistapaa entsyymi-inhibiittoreihin, jotka yleensä sitoutuvat entsyymien aktiivisiin kohtiin ja häiritsevät niiden toimintaa. Eri aminoglykosidiantibioottiluokat sitoutuvat rRNA:n eri kohtiin riippuen niiden rakenteellisesta komplementaarisuudesta. Esimerkiksi neomysiinin, paromysiinin (kuva 1), gentamysiinin ja kanamysiinin uskotaan sitoutuvan E. coli -bakteerin 16S rRNA:n A-kohtaan samalla tavalla, ja niiden osoitettiin suojaavan emäksiä A1408 ja G1494 kemiallisissa jalanjälkikokeissa (kuva 2) (33). Neljä emästä, A1408, A1492, A1493 ja G1494, ovat rRNA:n A-kohdassa vuorovaikutuksessa tRNA:n kanssa, joskin eri affiniteetilla. Edellä mainittujen aminoglykosidien sitoutuminen dekoodausalueen A-kohtaan (eli kodonien ja antikodonien tunnistuskohtaan) häiritsee rRNA:n tarkkaa tunnistamista tRNA:sta translaation aikana (35). Näiden vuorovaikutusten ajatellaan myös häiritsevän tRNA:n translokaatiota A-kohdasta peptidyyli-tRNA-kohtaan (P-kohta).
(A) Stereonäkymä 70S rRNA:n osittaisesta rakenteesta kompleksissa kolmen tRNA-molekyylin kanssa (Protein Databank -koodi, 486D). 16S rRNA:n A-kohdan alue on esitetty valkoisella, jossa aminoasyyli-tRNA ”A” (keltaisella) on sitoutunut lähelle rRNA:n A-kohtaa. Kaksi muuta tRNA:ta, peptidyyli- ja exit-tRNA, ”P” (punaisella) ja ”E” (vihreällä), on myös esitetty. 16S rRNA-molekyylin toiseksi viimeisen varren selkäranka ja 900-silmukka on esitetty violetilla. Paromysiinin sitoutumiskohta A-kohdassa on merkitty valkoisella nuolella. (B) Stereonäkymä paromysiinin sitoman RNA:n A-kohdan templaatin liuosrakenteesta, joka vastaa suunnilleen 16S rRNA:n A-kohdan aluetta valkoisella paneelissa A. A-kohdan RNA:n Connolly-pinta on renderöity sähköstaattisen potentiaalin mukaisesti käyttäen MOLCAD-ohjelmaa (Tripos, Inc., St. Louis, Mo.), ja aminoglykosidi on esitetty pallo-kepin esityksenä. Elektronegatiivisin potentiaali on esitetty sinisellä ja sähköpositiivisin potentiaali on esitetty punaisella pinnalla; kaikki muut värit kuvaavat sinisen ja punaisen välisiä potentiaaleja. Valkoisella merkitty nuoli osoittaa A1492:n synnyttämän solmun, jolla ei ole emäspariutumiskumppania. Keltainen nuoli osoittaa emäsparin A1408 – A1493 ja A1492 muodostaman taskun. Punainen nuoli osoittaa 3-amiinin sijainnin rengas II:lla, joka on paikka AAC(3):n suorittamalle asetylaatiolle.
Puglisi ja työtoverit (12-14, 39) toimittivat hiljattain rakenteellista näyttöä paromomysiinin, joka on edustava neomysiiniluokan aminoglykosidi, vuorovaikutustavasta 27-nukleotidisen RNA-templaatin kanssa, joka suunniteltiin jäljittelemään E. coli -bakteerin 16S-rRNA:n 16S-rRNA:n A-kohdan aluetta (kuva 3A). RNA-templaatin suunnittelu perustui aiempaan tietämykseen siitä, että paromomysiini on vuorovaikutuksessa emäsparin C1407 – G1494, A1408, A1493 ja U1495 kanssa ja että nämä emäkset ovat ehdottoman välttämättömiä korkea-affiniteettiselle sitoutumiselle (39) (esitetty harmaalla kuvassa 3A). Myös muut rakenteelliset piirteet, kuten A1492:n läsnäolosta johtuvan sisäisen silmukan alueen epäsymmetrian synnyttämä tasku ja C1409 – G1491:n emäspari alemmalla varren alueella, ovat tärkeitä. Nämä rakenteelliset ominaisuudet luovat yhdessä taskun, joka on optimaalinen paromysiinin sitoutumiselle (ks. jäljempänä).
(A) Paromomysiinin vuorovaikutusten tutkimiseen käytetyn A-kohdan RNA-mallin malli. Laatikko edustaa rRNA:n osaa, joka on homologinen A-kohdan kanssa. (B) RNA-aptameerimalli, jota käytettiin tobramysiinin vuorovaikutusten tutkimiseen.
Natiivissa A-kohdan RNA-mallissa varren emäspariutumisvuorovaikutukset ovat kohdissa U1406 – U1495 (ei-kanoninen) ja C1407 – G1494 (kuva 3A). Paromysiinin sitoutuessa A1408:n, A1492:n ja A1493:n muodostama erillinen rakenne stabiloituu (kuva 2B), ja emäkset A1408 ja A1493 muodostavat ei-kanonisen emäsparin (12, 39). Nukleotidi A1492, jolla ei ole emäspari-vuorovaikutuksia, luo RNA:n rakenteeseen solmun, ja A1492:n ja emäsparin A1408 – A1493 yhteisvaikutus luo A-kohtaan pullistuman, johon paromysiini sitoutuu ja joka pidentää solmun kulmaa entisestään (kuva 2B). Paromomysiinin funktionaaliset ryhmät, kuten hydroksyyli- ja aminoryhmät, osallistuvat spesifisiin vuorovaikutuksiin RNA-molekyylin kanssa (ks. jäljempänä).
A1492:n ja emäsparin A1408-A1493 luomassa taskussa on paromomysiinin rengas II, ja tämä rengas pinoutuu emäksen G1491 yläpuolelle (merkitty keltaisella nuolella kuvassa 2B) (12). Paromomysiinin rengas I muodostaa spesifisiä kontakteja rRNA:n ”yleisesti” konservoitujen emäsparien U1406 – U1495 ja C1407 – G1494 kanssa. On huomionarvoista, että rengas I on ehdottoman välttämätön aminoglykosidiantibioottien spesifiselle sitoutumiselle rRNA:han. Paromysiinin renkaat III ja IV laajentavat näitä vuorovaikutuksia pidemmälle rRNA:n pääuraan. Amino- ja hydroksyyliosat vaikuttavat enimmäkseen paromomysiinin epäspesifisiin vuorovaikutuksiin rRNA:n kanssa; ne eivät siis ole sekvenssistä riippuvia vuorovaikutuksia. Toinen tärkeä seikka on se, että emäspari C1409 – G1491 tarjoaa paikan aminoglykosidin sitoutumiselle taskussa, ja epäsuhtainen emäspari tässä kohdassa johtaa sitoutumisen häviämiseen (12). Yleisesti ottaen aminoglykosidit, joilla on yhteisiä rakennepiirteitä paromysiinin kanssa, sitoutuvat rRNA:han samalla tavalla (13). Eri aminoglykosidiantibiootit näyttävät kuitenkin sitoutuvan samaan sitoutumiskohtaan useammassa kuin yhdessä konformaatiossa (28). Pohjimmiltaan sen aminoglykosidin konformaation, joka sitoutuu RNA:han, on täytettävä sitoutumiskohdan elektroniset ja steeriset rajoitukset. Eräässä eri tutkimuksessa, joka koski gentamysiini Cla:n ja A-kohdan RNA-templaatin kompleksia, gentamysiini Cla:n renkaat I ja II (jotka ovat samanlaisia kuin paromomysiinin renkaat) osoittivat samanlaisia sitoutumisvuorovaikutuksia kuin paromomysiinin ja A-kohdan RNA-templaatin kompleksissa (57). Gentamisiini Cla:n rengas III on kuitenkin vuorovaikutuksessa emäsparien U1406 – U1495 ja G1405 – C1496 kanssa ylemmällä varsialueella (kuva 3A). Näiden havaintojen perusteella Puglisi ja työtoverit (57) ehdottivat, että kaikki 16S rRNA:n A-kohtaan kohdistuvat aminoglykosidit sitoutuvat yhteisellä tavalla, joka on samanlainen kuin paromysiinin ja gentamisiinin renkaat I ja II.
Vaikka rRNA:n yleinen rakenne on evolutiivisessa mielessä konservoitunut kaikilla lajeilla, on eroja, jotka tekevät aminoglykosidien sitoutumisesta spesifisempää – ainakin 10-kertaisesti suuremman affiniteetin – prokaryoottien rRNA:han kuin eukaryoottien rRNA:han (19, 35, 38). Tämä ei ole suuri ero sitoutumisaffiniteetissa, ja se saattaa osittain selittää näiden antibioottien toksiset vaikutukset nisäkkäiden järjestelmissä. Eukaryoottisessa rRNA:ssa on A1408:n tilalla guaniini, jolloin syntyy emäspari G1408 – A1493. Lisäksi eukaryooteissa ei ole vastaavaa emäsparia C1409 – G1491. Nämä erot yhdessä johtavat siihen, että aminoglykosidien affiniteetti eukaryoottiseen rRNA:han on pienempi (12, 19, 35, 38). Kun nämä erot on hahmoteltu, aminoglykosidien sitoutuminen rRNA:n A-kohtaan prokaryooteissa muuttaa A-kohdan konformaatiota ja vaikuttaa mRNA:n ja tRNA:n spesifisiin vuorovaikutussuhteisiin tässä kohdassa, mikä johtaa koodonin ja antikodonin epäsäännöllisiin vuorovaikutuksiin. Näiden vuorovaikutusten erityispiirteistä ribosomaalisella tasolla on toistaiseksi vain vähän rakenteellista tietoa (ks. jäljempänä), mutta selkeä ja lopullinen seuraus on translaatioprosessin häiriintyminen.
Toisessa rakennetutkimuksessa tutkittiin tobramysiinin (kuva 1) sitoutumista RNA-aptameeriin (23). Tässä tutkimuksessa käytetty RNA-ptameeri oli 26-nukleotidinen stem-loop RNA (kuva 3B). Tässä RNA-ptameerissa on neljä mismatch-paria, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 ja U11 – U16, jotka ovat osa vetoketjullista hiusneulasilmukkaa. Tobramysiini sitoutuu tähän uraan, joka on osittain kapseloitu syvän uran pinnan ja jäännöksen G15 guaniiniemästä (kuva 4). Tässä kompleksissa tobramysiinin rengas I istuu syvän uran pohjalla. Toinen tobramysiinin rengas II:n aminoryhmistä on vuorovaikutuksessa syvän uran fosfaattirungon kanssa, ja toinen aminoryhmä on alttiina liuottimelle. Rengas III sijaitsee syvän uran keskellä, ja hydroksyyliryhmät suuntautuvat kohti uran pohjaa. Edellä kuvatun RNA-aptameerin konformaation ehdotettiin muistuttavan tRNA:n ja rRNA:n hiusneulasilmukoiden konformaatiota (23).
Stereonäkymä RNA-aptameeriin sitoutuneen tobramysiinin kompleksista. Vihreä Connolly-pinta edustaa osaa aminoglykosidin sitoutumiskohdasta.
T. thermophilus 70S rRNA:n funktionaalisen kompleksin, joka sisältää tRNA:ta ja mRNA:ta, 7,5Å:n resoluutioinen röntgenrakenne on hyödyllinen edellä esitetyn keskustelun suhteuttamiseksi (5). Tämän rakenteen perusteella voisi kuvitella, miten hyvin pienemmillä RNA-malleilla, kuten tobramysiini-RNA-aptameerilla ja A-site-RNA:lla paromysiinin kanssa (ks. edellä) tehdyt mallitutkimukset sopisivat rRNA:n täydelliseen rakenteeseen. 70S rRNA:n 16S rRNA-alayksikön A-kohta näkyy lähellä tRNA:n ja 50S rRNA-alayksikön rajapintaa, kodoni-antikodoniparin läheisyydessä (kuva 2A). Kun A-kohdan RNA-mallin liuosrakennetta verrattiin 70S rRNA:n röntgenrakenteessa olevaan A-kohtaan, röntgenrakenne näytti olevan läheistä sukua paromysiiniin sitoutuneelle RNA-mallille mutta ei A-kohdan RNA-mallin natiiville liuosrakenteelle (5). Tämä on kiehtovaa ja viittaa siihen, että ehkä toiminnallisessa muodossa emästen A1492 ja A1493 lähellä oleva pullistuma tai mutka on aina olemassa 70S rRNA:ssa. Jos tämä pitää paikkansa, se merkitsee sitä, että paromysiinin sitoutumistasku on jo olemassa, kun 70S-rRNA:sta tulee toiminnallinen; näin ollen se on altis paromysiinin estämiselle. Tämä on ristiriidassa sen väitteen kanssa, jonka mukaan paromomysiinin sitoutuminen kasvattaa solmukulmaa sitoutumiskohdassa. Tämän ajatuksen tueksi on saatu näyttöä äskettäisestä tutkimuksesta, jonka mukaan eri aminoglykosidien affiniteetit A-kohdan RNA-templaattia kohtaan ovat erilaiset, ja myös näiden antibioottien kyky inhiboida proteiinisynteesiä in vitro vaihtelee (15). Gentamisiini ja useat muut sukulaisantibiootit ovat vuorovaikutuksessa A-kohdan RNA:n kanssa dissosiaatiovakioilla (Kd) mikromolaarisella alueella, mutta ne estivät in vitro -translaatioprosessia 50 %:n inhiboivien pitoisuuksien ollessa nanomolaarisella alueella (15). Jälkimmäinen havainto johtui aminoglykosidin sitoutumisesta ehjään rRNA:han dekoodausalueella (A-site), ja ero sitoutumisessa ehjään rRNA:han verrattuna sitoutumiseen A-site-templaatti-RNA:han voi johtua näiden kahden RNA:n konformaatioiden eroista, kuten edellä käsiteltiin.
A-site tekee heikkoja kontakteja mRNA:n ja tRNA:n kanssa, mikä viittaa siihen, että tällä alueella on rooli sopivan tRNA:n tunnistamisessa vapaan energian hienovaraisen muutoksen kautta (5). Aminoglykosidin sitoutuminen tämän kohdan läheisyyteen voi vaikuttaa kodonin ja antikodonin välisten vuorovaikutusten herkkään prosessiin. On myös ehdotettu, että aminoglykosidin läsnäolo stabiloi mRNA:n ja tRNA:n kompleksia A-kohdassa, mikä puolestaan vaikuttaa translaatioprosessiin (5). Kaikkia aminoglykosidien vaikutuksia rRNA:n rakenteeseen on vaikea arvailla, ja lisätutkimukset, joissa aminoglykosidit on sidottu komplekseihin, kuten 70S-rRNA:han, auttavat selvittämään ja ymmärtämään hienovaraisia muutoksia, jotka johtavat aminoglykosidien antibioottisiin vaikutuksiin.
Monissa tutkimuksissa on käytetty synteettisiä koettimia, jotta voitaisiin ymmärtää RNA-templaattien ja aminoglykosidien välisiä vuorovaikutuksia. On esitetty, että aminoglykosidit sitoutuvat useampaan kuin yhteen kohdekohtaan ribotsyymissä (6, 30). Useita aminoglykosidiantibiootteja, kuten neomysiini B:tä, tobramysiiniä ja kanamysiini A:ta, on hiljattain dimerisoitu joko symmetrisesti tai epäsymmetrisesti käyttämällä ”sideainetta”, ja niiden sitoutumisaffiniteetteja on verrattu monomeeristen emoaminoglykosidien affiniteetteihin (30). Ehdotettiin, että jos RNA:ssa on useita sitoutumiskohtia, dimerisoitujen aminoglykosidien pitäisi sitoutua suuremmalla affiniteetilla kuin kantaantibiootti, edellyttäen, että useita sitoutumiskohtia on käytettävissä. Todellakin havaittiin, että dimeroidut aminoglykosidit sitoutuvat Tetrahymenan ribotsyymiin 20-1 200-kertaisesti paremmin kuin emoaminoglykosidit. Yksi selitys korkeammalle sitoutumisaffiniteetille voisi olla positiivisesti varautuneiden aminoryhmien lisääntynyt määrä dimeroidussa aminoglykosidissa, mutta tämä vaikutus näyttää olevan synergistinen dimerisaatiosta saatavan entrooppisen edun kanssa (30). Se osoitti myös, että RNA-molekyylissä on useita korkean affiniteetin sitoutumiskohtia aminoglykosidiantibiooteille. Toisessa tutkimuksessa pyrittiin hyödyntämään paromysiinin RNA:ta sitovia ominaisuuksia ja tiettyjen yhdisteiden, kuten pyreenin ja tiatsolioranssin, interkaloivaa käyttäytymistä (48). Tässä strategiassa aminoglykosideja kaavailtiin keinoksi toimittaa interkaloivia aineita RNA:han. Paromomysiinin konjugaatti tiatsolioranssin tai pyreenin kanssa osoitti parempia sitoutumisominaisuuksia 27-nukleotidin A-kohdan RNA-templaattiin. Itse asiassa paromomysiini-tiatsolioranssi-konjugaatin dissosiaatiovakioksi mitattiin 46 nM, mikä ilmoitettiin korkeimmaksi affiniteetiksi, jota rRNA:n A-kohta on osoittanut millekään ligandille.
Aminoglykosidien RNA:han sitoutumisen rakenteelliset vaatimukset viittasivat siihen, että RNA:n sekvenssin pullistuma on välttämätön aminoglykosidien sitoutumisen mahdollistamiseksi (7). Käyttämällä RNA-aptameerin spesifistä stem-loop-johdannaista tehtiin sarja kemiallisia häiriö-, kemiallisia muunnos- ja mutaatiotutkimuksia, jotta ymmärrettäisiin rakenteelliset vaatimukset tobramysiinin sitoutumiselle RNA-ptameeriin. Tämä aminoglykosidi näytti olevan vuorovaikutuksessa pääasiassa RNA-ptameerin nukleiiniemästen mutta ei fosfaattirungon kanssa. Pullistuman läsnäolon ehdotettiin kuitenkin olevan tärkeää tobramysiinin korkean affiniteetin sitoutumiselle stoikiometrisessä suhteessa, ja pääteltiin, että pullistuma luo onkalon aminoglykosidin ja nukleiiniemästä peräisin olevan emäksen vuorovaikutusta varten (7). Tätä analogiaa voidaan soveltaa muihin RNA-kohtiin, kuten vasarapääalueeseen ja A-kohtaan, joissa on ontelo ei-kanonisen emäsparin tai silmukoiden tai pullistumien vuoksi, jotka luovat aminoglykosideille sopivan paikan vuorovaikutukseen anionisten fosfaattiryhmien ja nukleiinien emästen kanssa. Tämän suuntaisesti Westhoff ja kollegat (49) esittivät ehdotuksen, jonka mukaan aminoglykosidien vuorovaikutus RNA:n kanssa on todennäköisesti pikemminkin muotospesifistä kuin sekvenssispesifistä.
Tämän ajatuksen mukaisesti RNA:n poimujen sähköstaattisia kenttiä pidettiin sitoutumista ohjaavana voimana (ks. jäljempänä). Hermann ja Westhoff (20) pystyivät tunnistamaan useiden aminoglykosidiantibioottien telakoitumisvahvistukset erilaisiin RNA-malleihin, kuten tobramysiini-RNA-aptameereihin ja 16S-RNA:n A-kohdan alueeseen, joista oli saatavilla rakennetietoa. Näiden havaintojen perusteella ennustettiin aminoglykosidien sitoutumistapa HIV:n trans-aktivoivan vaste-elementin alueelle (20). Toisessa tutkimuksessa, joka koski HIV:n RRE:tä, Rev-proteiinin sitoutumisaluetta, Cho ja Rando (8) tutkivat yhden emäksen pullistuman ja onkalon merkitystä aminoglykosidien sitoutumiselle. Aiempien hypoteesien mukaisesti pääteltiin, että urat RNA:n nonduplex-alueilla ovat tärkeitä aminoglykosidien korkean affiniteetin sitoutumiselle RNA:han. Tässä tapauksessa yhden emäksen pullistuma ei vaikuttanut sitoutumiseen, mutta onkalolla, G-rikkaalla alueella, joka koostuu kahdesta ei-kanonisesta emäsparista ja yhdestä yksittäisestä pullistuneesta U:sta, on korkea affiniteetti aminoglykosideille. Ontelon peukalointi vähensi RRE RNA:n affiniteettia aminoglykosideja kohtaan, mikä osoittaa, että ei-kanonisia emäspareja sisältävät pullistumat ovat ensisijaisia aminoglykosidien sitoutumiskohtia tässä RNA-mallissa (8).