Soluviljelyreagenssit

Yhmisaktiivisen Akt1-ORF:n glyserolivarasto saatiin pENTR221-vektorina GE Dharmaconilta (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Modifioitu kohdevektori (pcDNA/FRT/TO), joka sisälsi SH-tagin, oli avokätinen lahja tohtori Matthias Gstaigerilta (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zürich, Zürich, Sveitsi). Flp-In TREx HEK293-solut (#R780-07), LR Clonase II -entsyymiseos (#11791-100), pOG44-vektori (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromysiini B (#10687-010), Tet (#550205) ja Dynabeads Protein A (#100.02D) saatiin Invitrogenilta. Xtremegene 9 (#06365787001) hankittiin Rochelta. DMEM (#12430-054) ja RPMI 1640 (#22400-089) saatiin GIBCO:lta. Trypsiini (#CC5027.010L) hankittiin Geneticsiltä. Normaali FBS (#SH30070.03) sekä Tet-seulottu FBS (#SH30070.03T) hankittiin Hyclonelta. Afidikoliini (#A0781-10MG), nokodatsoli (#M1404-10MG), propidiumjodidi (#P4170-250 mg) ja Lys C -proteaasi (#P3428) saatiin Sigmasta. SILAC-merkinnät hankittiin Cambridge Isotope Laboratories, Inc:ltä. Proteaasi-inhibiittorikoktail (100X) (#78429) ja Pierce anti-HA agaroosihelmet (#26182) saatiin Thermo Scientificiltä. MagStrep ’Type 2HC’-helmet (#2-1612-002) saatiin IBA BioTagnologylta. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Intia syntetisoi HA-peptidin. Nitroselluloosakalvo (#RPN303E) ostettiin GE Healthcare -yhtiöltä. Trypsiiniproteaasi (#4370282) hankittiin AB Sciexiltä. Täyden valikoiman sateenkaariproteiinien molekyylipainomarkkeri (#RPN800E) oli peräisin Amershamilta. siRNA:t, Dharmafect-transfektioreagenssi (#T-2001-03), RNaasivapaa vesi (#B-003000-WB-100), 5X siRNA-puskuri (#B-002000-UB-100) hankittiin Dharmaconilta. RNaasi A (#19101) oli peräisin Qiagenilta.

Vasta-aineet Western Blotia varten

Tässä tutkimuksessa käytetyt vasta-aineet olivat: anti-HA (#SC-7392; hiiren monoklonaalinen, laimennus 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; hiiren monoklonaalinen, laimennus 1:1000) ja anti-GAPDH (#SC-25778; kanin polyklonaalinen, laimennos 1:1000) Santa Cruzilta; anti-CDC2 (#77055; kanin polyklonaalinen, laimennos 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; kanin polyklonaalinen, laimennos 1:1000) Cell Signalling Technologylta; anti-BUB3 (#ab133699; kanin monoklonaalinen, laimennos 1:10000); anti-API5 (#ab56392; hiiren monoklonaalinen, laimennos 1:1000) ja anti-SH3PX1 (#EPR14399; kanin monoklonaalinen, laimennos 1:2000) Abcamilta; toissijaiset vasta-aineet hankittiin Licor Biosciences-Odyssey goat anti-mouse (#926-32210, laimennus 1:15000) ja Odyssey goat anti-rabbit (#926-32211, laimennus 1:15000).

Vakaan solulinjan tuottaminen

Tässä tutkimuksessa käytettiin porttiyhteensopivaa Akt1-tulovektoria (pENTR221) ekspressiokonstruktion tuottamiseen LR-rekombinaatioreaktiolla sopivan kohdevektorin (pcDNA/FRT/TO) läsnä ollessa. Määrävektori muutettiin siten, että se sisälsi streptavidiinia sitovan peptidin (Strep) ja hemagglutiniinin (HA) epitooppimerkin sisältävän Strep-HA (SH) tagin. Tätä SH-tunnistetta käytettiin lopulta Akt1:n ja sen vuorovaikutuskumppaneiden selektiiviseen poistamiseen monimutkaisista solulysaateista. Indusoituvan Akt1-ekspressiosolulinjan luomiseksi ekspressiokonstruktio transfektoitiin yhdessä pOG44-rekombinaasin kanssa Flp-In TREx HEK293-soluihin, jotka ilmentävät vakaasti Tet-repressoria. Transfektiota helpotettiin Xtremegene 9 -transfektioreagenssilla. Akt1-konstruktiota ilmentävät solut valittiin 15-20 päivän ajan hygromysiini-B:tä (75 µg/ml) sisältävässä RPMI-mediassa, jota täydennettiin 10 %:lla Tet-seulotulla FBS:llä. Nämä valitut solut yhdistettiin myöhemmin, jotta niitä voitiin laajentaa pulldown-kokeita varten.

Optimaalisen Akt1-ekspression edellyttämä Tet-konsentraatio määritettiin indusoimalla Akt1-ekspressio eri Tet-konsentraatioilla (0,1 µg/ml-5 µg/ml), ja Akt1:n proteiiniekspressiotasoja seurattiin Tet:n läsnäollessa ja poissaollessa käyttämällä anti-Akt1- ja anti-HA-vasta-ainetta. Tet:tä lisättiin kasvatusmediaan 24 tunnin välein vakaan Akt-ekspression ylläpitämiseksi.

PDT-koe

PDT:tä HEK293-soluille seurattiin normaaleissa vs. Akt1:tä yliekspressoivissa soluissa 72 tunnin ajan Tet:n alkuperäisen annon jälkeen. Kutakin havaintopistettä varten 104 normaalia ja Akt1-overexpressiivistä HEK293-solua kylvettiin rinnakkain kolminkertaisina 96-kuoppalevylle 100 µl:aan DMEM-mediaa, joka sisälsi 10 % seerumia. Tet-valmistetta lisättiin elatusaineeseen 24 tuntia kylvön jälkeen, ja toisen 24 tunnin inkubaatiovälin jälkeen solut kerättiin talteen ajankohtana 0. Tämän jälkeen rinnakkaisessa viljelyssä oleva solujoukko kerättiin talteen 24 tunnin välein aina 72 tuntiin asti. PDT määritettiin laskemalla solut kullakin ajanhetkellä trypaninsinivärjäysmenetelmällä.

SILAC-leimaus solusyklin vaiheille spesifisen Akt1-interaktomin erottamiseksi

Akt1-overexpressiivisiä HEK293-soluja laajennettiin ja kasvatettiin SILAC-medioissa, jotka sisälsivät lysiini- (K) ja arginiini- (R) isotooppeja ”kevyessä” (K0R0), ”keskiraskaassa” (K6R6) tai ”raskaassa” isotoopissa ”raskas (K8R10)”, vähintään 5 solukupolviutumisen ajan täydellisen leimojen sitoutumisen varmistamiseksi. Kun konfluenssi oli 70 %, Tet (1 µg/ml) lisättiin väliaineeseen Akt1-ekspression indusoimiseksi. K0R0-merkityt solut pysäytettiin G0-vaiheeseen yön yli kestävällä seerumin puutostilalla, joka on laajalti käytetty menetelmä solujen pysäyttämiseksi G0-vaiheeseen42. Tätä varten normaali täydellinen kasvatusmedia korvattiin seerumivapaalla RPMI:llä, ja soluja pidettiin viljelyssä 16-18 tuntia 37 °C:ssa ja 5 prosentin CO2-ilmakehässä. K8R10-leimatut solut pysäytettiin G1/S-vaiheeseen viljelemällä soluja yön yli 5 µg/ml afidikoliinia, joka on eukaryoottisen ydin-DNA:n replikaation palautuva estäjä43. Vastaavasti G2-pysäytystä varten K6R6-leimattujen solujen elatusaineeseen lisättiin 400ng/ml nokodatsolia, ja inkubointia jatkettiin 16-18 tuntia ennen solujen pelletöintiä. Nokodatsoli häiritsee mikrotubulusten polymerisaatiota, jolloin solut pysähtyvät G2/M-vaiheeseen44. Pysähtyneet solut trypsiinöitiin ja laskettiin erikseen trypansinivärjäysmenetelmällä. Eri solusyklin vaiheissa pysähtyneet solut pelletoitiin sentrifugoimalla 1500 rpm 10 minuutin ajan. Kutakin solusyklin vaihetta varten tehtiin useita solupellettejä, jotka säilytettiin -80 °C:ssa, kunnes ne käytettiin.

SH-merkittyjen affiniteettipuhdistus

Yhtä monta G0-, G1/S- ja G2-vaiheissa pidättäytynyttä Akt1-overexpressiivistä solua sekoitettiin 1:1:1-suhteessa ja lysoitiin jäällä 1 tunnin ajan IP-puskurissa (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1 % NP-40; 1X proteaasinestäjäcocktailia ja 1 mM PMSF:ää). Solulysaatista poistettiin solujäänteet sentrifugoimalla 10 000 rpm 15 minuutin ajan 4 °C:ssa. Akt1-proteiinikompleksit puhdistettiin selektiivisesti rinnakkaisina sarjoina kohdentamalla Strep- ja HA-tagia samanaikaisesti, kuten vastaavien sarjojen käsikirjoissa on ohjeistettu. Lyhyesti sanottuna strep-merkityt Akt1-proteiinikompleksit sekoitettiin 100 µl:n streptaktiinimagneettihelmien kanssa ja inkuboitiin 1 tunnin ajan pyörivällä ravistimella 4 °C:ssa. Epäspesifiset interaktorit pestiin pois viiden peräkkäisen pesuvaiheen aikana viidellä helmetilavuudella streptaktiinipuskuria. Akt1-proteiini ja sen interaktorit eluoitiin lopulta kahdessa eluointivaiheessa 125 µl:lla strep-eluutiopuskuria eluutiota kohti (invitrogen). HA-merkittyjen Akt1-proteiinikompleksien puhdistusta varten puhdistettuja solulysaatteja inkuboitiin 50 µl:n esipestyjen HA-agaroosihelmien kanssa 2 tunnin ajan 4 °C:ssa pyörivällä ravistimella. Kolmen nopean pesun jälkeen kymmenen helmetilavuuden TBS-T-puskurilla Akt1-proteiinikompleksit eluoitiin kolmesti 50 µl:lla HA-peptidiä (250 µg/ml). Edellä mainitut puhdistusvaiheet suoritettiin kolmelle tällaiselle biologiselle replikaatille Akt1-proteiinin ja sen vuorovaikutuskumppaneiden puhdistamiseksi, ja kunkin replikaatin Strep- ja HA-eluaatit yhdistettiin, lyofilisoitiin ja säilytettiin -80 °C:ssa jatkokäsittelyä varten.

Proteiinien pilkkominen ja näytteen valmistelu LC-MS/MS:ää varten

Proteiinien pilkkominen käsiteltiin kaikissa kolmessa biologisessa replikaatissa erikseen. Lyofilisoituun näytteeseen lisättiin 40 µl 100 mM ammoniumbikarbonaattia, vorteksoitiin hyvin ja sen jälkeen lisättiin 2 µl denaturointipuskuria (AB Sciex). Näytteet pelkistettiin 4 µl:lla pelkistysreagenssia (AB Sciex) 1 tunnin ajan 60 °C:ssa. 2 µl kysteiiniblokkausreagenssia lisättiin 10 minuutiksi huoneenlämpötilassa pelkistyneiden kysteiinijäämien blokkaamiseksi. Proteiinien pilkkominen aloitettiin lisäämällä 5 µl 0,1 µg/µl endoproteinaasi Lys C:tä. Näytteitä inkuboitiin 4 tuntia 37 °C:n vesihauteessa. Lyhyen pyöräytyksen jälkeen näytteisiin lisättiin 1 µl trypsiiniä (1 µg/µl) ja inkubointia jatkettiin vielä 12-16 tuntia 37 °C:ssa. Proteiinien pilkkominen lopetettiin lisäämällä tippa muurahaishappoa (FA).

Hapotetut näytteet lyofiloitiin ja niille tehtiin peptidipuhdistus monospin C-18 -kolonnilla. Ennen käyttöä C-18-kolonnit ilmastettiin metanolilla ja vedellä ja tasapainotettiin edelleen 3 % ACN:llä 0,1 % FA:ssa. Liofiloidut näytteet liuotettiin 3 % ACN:ään 0,1 % FA:ssa, ladattiin C-18-kolonniin ja annettiin sitoutua 10 minuutin ajan. Näytteet ohjattiin kahdesti kolonnien läpi täydellisen sitoutumisen varmistamiseksi. Kymmenen tiukan pesun jälkeen 3 % ACN:llä 0,1 % FA:ssa sulatetut peptidit eluoitiin ensin 40 % ACN:llä ja sen jälkeen kahdella eluoinnilla 60 % ACN:llä. Lopuksi kolme eluaattia yhdistettiin ja lyofilisoitiin kutakin toistoa varten.

Eluoidut peptidit liuotettiin uudelleen 500 µl:aan 5 mM ammoniumformiaattia (pH 2,5) 30-prosenttisessa ACN:ssä ja vorteksoitiin varovasti. Kationinvaihtopatruuna kiinnitettiin ja ilmastettiin ennen näytteen lataamista. Näytteen lataamisen jälkeen patruuna pestiin kolmesti 5 mM ammoniumformiaatilla (1 ml). Peptidit eluoitiin uudelleen kahdesti 400 µl:lla 500 mM ammoniumformiaattia (pH 2,5) 30-prosenttisessa ACN:ssä eluutiota kohti, ja eluaatit yhdistettiin kutakin näytekertaa varten ja lyofiloitiin.

Massaspektrometrinen koesuunnitelma ja tilastolliset perusteet

LC-MS/MS-analyysi

Kaikki näytteet analysoitiin nanovirtausnestekromatografialla nanoflex-järjestelmässä (Eksigent Technologies, AB Sciex), joka oli kytketty kolminkertaiseen TOF 5600-massaspektrometriin (AB Sciex; Concord, Kanada). Kukin biologinen toisto injektoitiin kahdesti teknisinä toistoina. Järjestelmää käytettiin käyttäen binäärifaasigradienttia, jossa liuotin A (2 % ACN 0,1 % FA:ssa) ja liuotin B (98 % ACN 0,1 % FA:ssa). Näytteen optimaalisen toistettavuuden varmistamiseksi automaattista näytteenottolaitetta käytettiin täydessä injektiotilassa, jolloin 1 µl:n silmukka täyttyi 3 µl:lla näytettä. Kunkin näyteinjektion mittauksia varten peptidit loukutettiin cHiPLC-loukkuun, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) ja erotettiin cHiPLC-kolonnissa, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) 300 nl/minuutin virtausnopeudella käyttäen lineaarista gradienttia: 5-60 % liuotin B 80 minuutissa, 60-90 % 2 minuutin ajan. Kolonni regeneroitiin pesemällä 90-prosenttisella liuottimella B 6 minuutin ajan ja ekvibroitiin uudelleen 5-prosenttisella liuottimella B 22 minuutin ajan.

Massaspektrometri oli kytketty Nano Spray -ionilähteeseen (AB Sciex), jota ohjattiin Analyst-ohjelmistolla (v.1.6). Ionilähde oli varustettu 10 μm SilicaTip electrospray PicoTip emitterillä (AB Sciex) ja eluoituneita peptidejä seurattiin seuraavilla ionilähteen parametreilla: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, verhokaasu = 25. Massaspektrometriä käytettiin informaatiosta riippuvaisessa hankintatilassa (IDA) top10-tilassa ja korkean herkkyyden tilassa, jossa MS1- ja MS2-skannausten akkumulaatioaika oli 500 ja 200 sekuntia ja dynaaminen poissulkeminen 12 sekuntia, jolloin kokonaistyöjakso oli ~2,55 sekuntia. Massaspektrometrin analyysi suoritettiin käyttämällä TOF-MS1- ja MS2-mittaustutkimuksen skannauksia, jotka vaihtelivat välillä 350-1250 ja 140-1600 m/z. Vierintätörmäysenergiaa säädettiin automaattisesti IDA:n vierintätörmäysenergiaparametrien skriptillä. Fragmentoitavan emoionin valintakriteereihin kuuluivat intensiteetti, jossa ionien oli oltava yli 150 cps, massatoleranssi 50 mDa ja varaustila +2 – +5. Spektrien automaattinen kalibrointi tehtiin jokaisen kahden näytteen hankinnan jälkeen käyttäen dynaamista LC-MS- ja MS/MS-hankintaa 25 fmol β-galaktosidaasista.

Datan käsittely ja analyysi

MS-MS-hankinta Akt1:n ja sen vuorovaikutuksessa olevien proteiinikumppaneiden välillä välitettiin kolmessa eri solusyklin vaiheessa eli G0-, G1/S- ja G2-vaiheessa. Kutakin vaihetta edustavat SILAC-merkityt solut yhdistettiin kolmeksi erilliseksi sarjaksi ja niitä tutkittiin biologisina toistoina. Kustakin biologisesta replikaatista saatiin 2 wiff- ja 2 wiff.scan-tiedostoa, jotka edustavat sen teknisiä replikaatteja. Wiff-tiedostot yhdistettiin jälleen kunkin biologisen replikaatin osalta ennen hakua UniProtKB/SwissProt Human -tietokannasta (julkaisu huhtikuu 2015) käyttäen Protein Pilot -ohjelmiston versiota 4.5 (versio nro 1656). Vertailutietokanta koostui 20 204 proteiinimerkinnästä kyseisessä julkaisussa. Protein pilot -haku perustui paragon-algoritmiin, joka on osa ohjelmiston oletustilastoja. Paragon-hakuja varten käytettiin seuraavia asetuksia: (a) laji Homo sapiens, (b) Lys C ja trypsiini entsyymiluokkina eri ajoissa, (c) maksimi missed cleavages = 2, (d) kiinteät modifikaatiot SILAC-merkkeinä K6R6 ja K8R10; kysteiinin alkylointi metyylimetanietiosulfonaatilla (MMTS), e) muuttuvat modifikaatiot metioniinin hapettumisena, joka on proteiinipilotissa oletusvaihtoehto, f) identifiointi, näytetyyppeinä SILAC (Lys + 6, Arg + 6) ja SILAC (Lys + 8, Arg + 10), g) ”Search Effort” -parametrina ”Thorough ID” (”Perusteellinen tunnistus”), joka mahdollistaa laajan haun proteiinien erilaisista modifikaatiomuodostelmista, h) massatoleranssi esiaste- ja pätö-ionien kohdalla oli 0.05 ja 0,1 Da. Kullekin biologiselle toistolle luotiin SILAC-merkkiä kohden Lys C- ja Trypsin-digestoidut tiedostot. Seuraavia parametreja käytettiin datan suodattamiseen, jotta saatiin luotettava datasarja myöhempää analyysia varten: (a) Sovellettiin automaattista bias-korjausalgoritmia raskaan ja kevyen suhteen suhteen korjaamiseksi. Se korjaa epätasaisen sekoittumisen eri leimattujen näytteiden yhdistämisen aikana samassa kokeessa ja poistaa kaikki kokeelliset tai systemaattiset vääristymät. Automaattinen bias-kerroin lisää kvantifioinnin tarkkuutta normalisoimalla proteiinien alkuperäisten määrien vaihtelut45, (b) Proteiinit, joilla oli 1 %:n globaali väärän löydön osuus (FDR) sovituksesta (G-FDR-sovitus), säilytettiin. FDR-analyysi suoritettiin käyttämällä Proteomics Performance Evaluation Pipeline -ohjelmistoa (PSPEP), joka on asennettu Protein Pilot -ohjelmiston mukana, c) Proteiinien vähimmäisluottamuskynnyksen raja-arvoksi asetettiin 95 %, d) Vähintään yhden yksilöllisen peptidin tunnistaminen 95 %:n luottamuksella kaikissa kolmessa toistossa.

Luettelot proteiineista, jotka saatiin Lys C:n ja trypsiinin sulatuksen jälkeen, yhdistettiin biologista toistoa kohti. Keskiraskaiden ja raskaiden SILAC-leimattujen proteiinien kvantitointisuhteet suhteessa niiden kevyempiin proteiineihin laskettiin keskiarvona. Tämän jälkeen saatiin kolme proteiiniluetteloa kutakin SILAC-merkintää kohti: K0R0, K6R6 ja K8R10. Tämän jälkeen laadittiin yhdistelmäluettelo tunnistetuista proteiineista; Kvantitatiivinen arviointi kuratoitiin manuaalisesti yhdistämällä tiedostot kolmesta biologisesta toistosta kunkin SILAC-olosuhteen osalta. Proteiinit, jotka tunnistettiin kaikissa kolmessa toistosarjassa, säilytettiin myöhempää analyysia varten, ja näiden proteiinien keskiraskaiden ja raskaiden leimojen kvantitatiiviset suhteet kevyisiin leimoihin nähden laskettiin keskiarvona. Tämän jälkeen laadittiin lopullinen yhdistetty tiedosto K0R0 (G0-vaihe), K6R6 (G2-vaihe) ja K8R10 (G1/S-vaihe). Proteiini kelpuutettiin lopulliseen Akt1-vuorovaikuttajien luetteloon vain, jos se tunnistettiin kaikissa kolmessa toistosarjassa minkä tahansa solusyklin vaiheen osalta. Proteiineille, jotka tunnistettiin mutta joita ei kvantifioitu kaikissa kolmessa toistossa, annettiin kvantifiointiarvo 0,01 (minimi) tai 100 (maksimi) sen jälkeen, kun ne oli sisällytetty peptidien SILAC-suhteisiin.

Jotta Akt1-vuorovaikuttajaluettelo saatiin karsittua entisestään epäspesifisistä vuorovaikutuksista affiniteettimatriisin tai tunnisteen kanssa sinällään, SH-merkittyä GFP:tä yli-ilmentettiin HEK293-soluissa. GFP-proteiinin vuorovaikutuskumppanit eluoitiin selektiivisesti Akt1-proteiinikompleksien osalta kuvatulla tavalla. Proteiinit, jotka olivat päällekkäisiä Akt1:n solusyklin vaiheelle spesifisen interaktomin kanssa, poistettiin Akt1:n interaktoreiden luettelosta epäspesifisinä proteiineina. Näin saatiin lopulta luotettava tietokokonaisuus Akt1:n vuorovaikutuskumppaneista. Yhteenveto Akt1:n vuorovaikuttajaproteiineja koskevista tiedoista ja niiden kvantitatiivisista arvioista on esitetty lisätaulukossa 3. Jakamalla ne Akt1-suhteen kanssa vastaavassa vaiheessa normalisoitiin kaikkien Akt1-vuorovaikuttajien kvantitatiiviset suhteet. Näin saatiin Akt1:lle yhdenmukaisuus kuin 1 G0-, G1/S- ja G2-vaiheissa.

Polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja Western blotting

Identifioitujen Akt1-vuorovaikuttajien luettelosta valittiin satunnaisesti CDK1, CCNB1, BUB3, API5 ja SH3PX1, jotta niiden assosiaatio Akt1:n kanssa voitiin validoida Western blottingin avulla. Asynkronoitu Akt1:tä ilmentävä solupelletti lysoitiin IP-puskurissa ja sille tehtiin affiniteettipuhdistus, joka kohdistettiin SH-tagiin, kuten edellä on kuvattu. Eluaatit yhdistettiin ja laimennettiin 1X SDS-näytepuskuriin ja lämmitettiin 10 minuuttia ja erotettiin 10 % SDS-PAGE:lla. Proteiinikaistat siirrettiin nitroselluloosakalvolle ja jälkimmäinen estettiin käyttämällä 1:1 odyssey-blokkauspuskuria: PBS tunnin ajan huoneenlämmössä. Seuraavaksi kalvo leikattiin, jotta erikokoisia proteiineja voitiin koestaa vastaavilla primaarivasta-aineilla, jotka validoitiin yhdessä anti-HA-vasta-aineen kanssa. Primäärivasta-aineen laimennus tehtiin odyssey-puskurissa: PBST ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa ravistimella. Perusteellisen pesun jälkeen blotit altistettiin vastaaville IR-merkityille antihiiri- tai anti-kaniini toissijaisille vasta-aineille laimennoksella 1:15000; laimennettiin odyssey-puskuriin: PBST. Bändit havaittiin odyssey-infrapunaskannerilla.

Käänteinen koimmunoprecipitaatio tehtiin myös käyttämällä Dynabeads-proteiinia A. Aiemmin havaittuja Akt1-vuorovaikuttajia käytettiin syöttiproteiineina ja Akt1:n vuorovaikutuskumppania tutkittiin anti-Akt1-vasta-aineella. Valittujen Akt1-interaktoreiden vasta-aineet sekoitettiin 50 µl:aan dynabeadsia erillisissä putkissa pitoisuudella 1:20-1:70; laimennettiin 200 µl:aan PBST:tä. Helmet-vasta-aine-seoksia pidettiin inkuboitavana huoneenlämmössä 10 minuuttia. Helmet-vasta-ainekompleksit pelletoitiin magneettierottimella ja suspendoitiin uudelleen 200 µl:aan PBST:tä pesua varten. Tämän jälkeen jokaiseen putkeen lisättiin 250 µl lysaattia ja inkuboitiin 4 °C:ssa 2 tuntia pyörivällä ravistimella. Helmet ja vastaavat vasta-aine-antigeenikompleksit pelletoitiin uudelleen ja pestiin kolmesti 200 µl:lla PBST:tä pesua kohden. Tämän jälkeen helmiä keitettiin 50 µl:ssa 1X SDS-näytepuskuria 10 minuutin ajan ja jäähdytettiin. Supernatantti ladattiin 10-prosenttiselle SDS-PAGE:lle ja tutkittiin western blottingilla. Anti-Akt1-vasta-ainetta käytettiin Akt1:n etsintään API5:n, CCNB1:n, CDK1:n, BUB3:n ja SH3PX1:n eluoinnissa.

GO-luokitus

Kunkin Akt1-interaktorin toimintaa kuvaavatGO-luokat määritettiin UniProt- (http://www.uniprot.org/) ja EnrichR-tietokannoista (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Laajan manuaalisen kuratoinnin jälkeen tunnistetut Akt1-interaktorit jaettiin kolmeen tärkeimpään funktionaaliseen luokkaan, jotka ovat proliferaatio ja eloonjääminen, metabolia ja proteiinisynteesi. Loput kuvattiin yhteisenä luokkana nimeltä ”muut”, joka sisälsi proteiineja, joilla on toimintoja, kuten kuljetus, hematopoeesi jne.

Geenien knockdown siRNA:n avulla

Standardisointi

SiRNA:n optimaalisen konsentraation määrittelemiseksi transfektiota varten kylvettiin 12-kuoppalevyyn 1,2 × 105 HEK293-solua. PLK1:tä vastaan suunnattua siRNA:aa käytettiin positiivisena kontrollina kaikissa knockdown-testeissä. SiRNA-pitoisuudet 10 nM:stä 50 nM:iin transfektoitiin käyttämällä dharmafect-transfektioreagenssia toimittajan protokollan mukaisesti. Proteiiniekspressiotasojen muutoksia seurattiin western blotting -menetelmällä 24 tunnin, 48 tunnin ja 72 tunnin kohdalla (täydentävä kuva 2). Muutamia muita kohteita (SH3PX1, AKT1, CCNB1 ja SLC25A5) tyrmättiin ja tyrmäyksen vaikutus määritettiin western blottingilla. GAPDH:ta käytettiin latauskontrollina.

Kohdeproteiinien knockdown

Proteiinit, jotka osoittivat häiriintynyttä assosioitumista Akt1:n kanssa solun edetessä solusyklin G0-vaiheesta G1/S-vaiheeseen, knockdownattiin yksitellen HEK293-soluissa ja tutkittiin FACS:llä. Kukin siRNA suspendoitiin uudelleen 1x siRNA-puskuriin, jotta saatiin 20 µM:n varastokonsentraatio. Transfektio välitettiin kolmena kappaleena 24 tuntia solujen kylvön jälkeen; yhdessä asianmukaisten positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Kukin siRNA laimennettiin 25 nM:n työkonsentraatioon RPMI:ssä siten, että lopullinen tilavuus oli 50 µl, ja sitä pidettiin huoneenlämmössä 5 minuutin inkubaation ajan. Samoin transfektioreagenssi laimennettiin RPMI:ssä 50 µl:n tilavuudeksi ja säilytettiin inkubointia varten samanlaisissa olosuhteissa. Sekä siRNA että transfektioreagenssi sekoitettiin varovasti kompleksien muodostamiseksi ja inkubointia jatkettiin vielä 20 minuuttia huoneenlämmössä. Lopullinen tilavuus täydennettiin 500 µl:ksi väliaineella, joka sisälsi 10 % seerumia. Nämä kompleksit lisättiin sitten varovasti soluihin ja inkubointia jatkettiin 37 °C:ssa. Soluviljelymedia korvattiin tuoreella 10 %:n medialla 24 tunnin kuluttua. Lopuksi 48 tuntia transfektion jälkeen transfektion tehokkuus määritettiin tarkkailemalla siGLO:ta Nikon Ti -invertoidulla mikroskoopilla.

FACS-hankinta ja analyysi

Kuinka 48 tuntia transfektion jälkeen solut sentrifugoitiin lyhyesti ja väliaine imettiin. Soluja värjättiin 300 µl:lla propidiumjodidiliuosta, joka sisälsi 0,1 mg/ml propidiumjodidia (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100:a (Sigma), 1 mg/ml natriumsitraattia (Sigma) ja 20 µg/ml RNaasia (Sigma) 30 minuutin ajan 4 °C:ssa. Värjätyt solut siirrettiin välittömästi BD FACS -putkiin ja kuvattiin BD FACS Cantossa.

Saadut tiedot analysoitiin FlowJo-ohjelmistolla. DNA-histogrammit analysoitiin G0-, G0/G1-, S- ja G2/M-populaatioiden kvantifioimiseksi. G0/G1- ja G2/M-populaatioissa havaittiin vähäisiä siirtymiä, joten näiden populaatioiden analysoimiseksi tehtiin manuaalinen gating.

PDT- ja RT-laskenta

PDT- ja RT-arvot solusyklin G1-, S- ja G2-vaiheissa laskettiin sen jälkeen, kun oli saatu poistettua siRNA:lla joukko proteiineja, jotka osoittivat häiriintynyttä assosiaatiointia Akt1:n kanssa G1/S-vaiheessa. 23 geenin PDT:tä ja kontrolleja seurattiin HEK293-soluissa 72 tunnin ajan. Lyhyesti sanottuna 10 000 solua kylvettiin 96-kuoppalevylle 100 µl:aan RPMI-mediaa, jossa oli 10 % seerumia. siRNA-transfektio välitettiin seuraavana päivänä kolmena kappaleena kullekin kohdeproteiinille ja sitä pidettiin 0 tunnin aikapisteenä. Solujen lukumäärä määritettiin käsittelemättömille HEK293-soluille trypaninsinivärjäysmenetelmällä. 24 tunnin kuluttua siRNA-komplekseja sisältävä soluviljelyaine korvattiin tuoreella RPMI:llä, joka sisälsi 10 % seerumia. Tämän jälkeen solut laskettiin jokaisesta siRNA-transfektoidusta solusta 24 tunnin aikapisteen edustamiseksi. Tämän jälkeen kerättiin ja laskettiin rinnakkaisviljelyssä olevat solut 48 tunnin ja 72 tunnin aikapisteissä.

Kun PDT oli määritetty kaikille kohdennetuille häiriintyneille geeneille, RT (tunteina) jokaiselle laskettiin G1-, S- ja G2-vaiheen osalta seuraavasti:

where; % solupopulaatio määritettiin FACS-mittauksen avulla.

Tietojen saatavuus

Massaspektrometriatiedot talletettiin tietokokonaisuutena ”Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” ProteomeXchangeen PRIDE-tietokannan kautta. Se on julkisesti saatavilla ProteomeXchangen kautta tunnisteella ProteomeXchange: PXD005557. Aineisto koostuu 12 raakatiedostosta (wiff ja wiff.scan) ja niihin liittyvistä 18 proteiinipilottitiedostosta.