Geeniterapia ei-perinnöllisten sairauksien hoitoon

Kroonisiin elinvaurioihin liittyvien mekanismien tunnistamisessa on edistytty paljon, mikä on avannut mahdollisuuksia geeniterapiatutkimuksille. Vaikka viime vuosikymmeninä on tehty lukuisia prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia, joissa on keskitytty kehittämään geeniterapiaa perinnöllisiä sairauksia varten, useista eläinmalleilla tehdyistä prekliinisistä tutkimuksista huolimatta on tehty vain muutamia kliinisiä tutkimuksia, joissa on tutkittu geeniterapian terapeuttista tehokkuutta ei-perinnöllisten sairauksien hoidossa. Tuore tutkimus osoittaa, että telomeraasin ilmentymisellä AAV9-vektoreilla on terapeuttisia vaikutuksia keuhkofibroosin hiirimallissa. Tämä hoito kohdistui idiopaattiseen keuhkofibroosiin. Telomeerien tiedetään toimivan suojaavina rakenteina kromosomien päissä, ja lyhyiden telomeerien on osoitettu olevan yksi syy sairauksien kehittymiseen. Tässä tilassa telomeerit lyhenevät liian lyhyiksi, mikä johtaa solujen jakautumisen loppumiseen, mikä puolestaan johtaa solujen apoptoosiin. Telomeraasi on entsyymi, joka voi järjestää telomeerien pituuden uudelleen, ja Povedano kollegoineen kehitti AAV-serotyypin 9 avulla hoidon, jossa telomeraasia siirretään lyhyiden telomeerien korjaamiseksi. Koska AAV9 kohdistuu ensisijaisesti regeneroituviin alveolaarisiin tyypin II soluihin (ATII), AAV9-Tert-käsitellyillä hiirillä keuhkojen toiminta parani ja tulehdus ja fibroosi vähenivät 1-3 viikon kuluttua vektorikäsittelystä. On mielenkiintoista huomata, että keuhkofibroosi joko parani tai hävisi 8 viikon kuluttua geenihoidosta. AAV9-Tert-hoito johti pidempiin telomeereihin ja ATII-solujen lisääntyneeseen proliferaatioon sekä vähäisempiin DNA-vaurioihin, apoptoosiin ja senesenssiin.

AAV-vektorista peräisin oleva sydämen geeniterapia on nousemassa täysin uudeksi alustaksi sydänsairauksien hoidossa. Sydämen vajaatoiminnan AAV-geenihoito on validoitu prekliinisissä tutkimuksissa eläinmalleilla, ja valtaosa näistä lähestymistavoista on pyritty parantamaan kalsiumin käsittelyä kardiomyosyyteissä. Terapeuttinen proteiini, jota käytettiin useimmissa näistä tutkimuksista, oli sarkoplasmaattinen kalsium-ATPaasi (SERCA2a). Myönteisten prekliinisten tulosten perusteella tehtiin ensimmäinen kliininen tutkimus (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422), jossa SERCA2a:ta annosteltiin AAV-serotyypin 1 vektorilla pitkälle edennyttä sydämen vajaatoimintaa sairastavien potilaiden hoitoon. Tämän vaiheen 1 tutkimuksen tulokset olivat menestyksekkäitä ilman haittatapahtumia, ja se eteni vaiheen 2a tutkimukseen, jossa saatiin lupaavia tuloksia, ja haittatapahtumien määrä oli huomattavan alhainen. Vaiheen 2b kliinisen tutkimuksen (CUPID2b-tutkimus, NCT01643330), jossa käytettiin samaa vektoria, tulokset olivat kuitenkin pettymys, sillä hoitoryhmän ja lumelääkeryhmän välillä ei tapahtunut merkittävää muutosta. Tämä on johtanut siihen, että potilaiden rekrytointi kahteen muuhun tutkimukseen, joissa käytettiin AAV1.SERCA2a:ta, on lopetettu. Mielenkiintoista on, että tulossa on kaksi uutta tutkimusta, joiden tarkoituksena on tuottaa S100A1:tä AAV9-vektorilla ja proteiinifosfataasi 1:n estäjien konstitutiivisesti aktiivista muotoa I1c:tä kimeerisellä kapsidilla, jossa on AAV2- ja AAV8-serotyypit. Lisäksi AAV1, AAV6 ja AAV9 ovat osoittautuneet lupaavimmiksi AAV-serotyypeiksi sydämen geeninsiirrossa, mikä antaa toiveita onnistuneista geeniterapiamenetelmistä sydämen vajaatoiminnan hoidossa tulevaisuudessa.

AAV-välitteisistä geeniterapiamenetelmistä neuropaattisen kivun hoitamiseksi jyrsijöillä on myös raportoitu . Fischer ja kollegat ovat osoittaneet, että Ca2+-kanavaa sitovaa domain 3 -geeniä (CBD3) ilmentävän rAAV-geenin antaminen vähensi merkittävästi kipukäyttäytymistä, kuten hyperalgesiaa nuppineulan kosketuksen jälkeen tai herkkyyttä asetonistimulaatiolle tulehduksellisen ja neuropaattisen kivun eläinmalleissa . Toinen tutkimus, jossa käytettiin AAV9-vektoria, joka koodaa lyhyttä hiusneulan RNA:ta (shRNA) vanilloidireseptoria 1 (TRPV1) vastaan, joka on tärkeä akuutin kivun kohdegeeni, osoitti, että hoito vaimensi hermovaurion aiheuttamaa lämpöallodyniaa (hermosolujen lisääntynyt vaste) 10-28 päivää hoidon jälkeen hiirimallissa, jossa oli säästynyt hermovaurio (SNI) . Nämä tulokset tarjoavat positiivista näyttöä, joka rohkaisee geeniterapian tutkijoita kehittämään AAV-vektoripohjaisia hoitoja kroonista/diabeettista neuropaattista kipua sairastaville potilaille.

Kroonisen maksafibroosin hoitoon tähtäävässä geeniterapiassa on edistytty huomattavasti. Vaikka angiotensiinikonvertaasientsyymin (ACE) estäjiä tai angiotensiinireseptorin salpaajia (ARB) käytetään laajalti verenpainetautipotilaiden hoitona, niitä on kokeiltu kroonista maksasairautta sairastavilla potilailla; tulokset eivät kuitenkaan olleet vakuuttavia pääasiassa siksi, että ne aiheuttavat haitallisia systeemisiä sivuvaikutuksia . Lääkehoitojen puuttuessa maksansiirrosta on väistämättä tullut ainoa vaihtoehto potilaille, joilla on kroonisesta maksafibroosista ja/tai maksakirroosista johtuva loppuvaiheen maksasairaus. Lisäksi kroonisen maksasairauden yleistyminen, luovuttajaelinten puute, elinsiirron jälkeiset komplikaatiot ja maksansiirron korkeat kustannukset merkitsevät sitä, että on suuri tarve löytää ja muotoilla spesifisiä, tehokkaita, turvallisia ja edullisia uusia hoitomuotoja maksan fibroosin/kirroosin hoitoon.

Yksi mahdolliseksi lähestymistavaksi tämän ongelman kiertämiseksi on kehittää elinkohtaisia fibroosin vastaisia strategioita. Laboratoriomme tutkimukset osoittivat, että yksi mahdollinen kohde on reniini-angiotensiinijärjestelmän (RAS) ”vaihtoehtoinen akseli”, johon kuuluu sen avainentsyymi angiotensiinikonvertaasin 2 (ACE2), joka pilkkoo voimakkaan profibroottisen oktapeptidin, angiotensiini II:n (Ang II) antifibroottiseksi heptapeptidiksi, angiotensiini-(1-7) (Ang-(1-7)) . Kokeellisista eläinkokeista saadut todisteet osoittivat, että ihmisen rekombinantti ACE2 (rhACE2) on hyödyllinen verenpainetaudin ehkäisyssä sydän- ja verisuonisairauksissa ja parantaa munuaisten toimintaa diabeettisessa nefropatiassa . Mielenkiintoista on, että ryhmä terveitä vapaaehtoisia ihmisiä sieti rhACE2:ta hyvin vaiheen 1 kliinisessä tutkimuksessa ilman ei-toivottuja kardiovaskulaarisia sivuvaikutuksia . Yhdessä tutkimuksessa raportoitiin rekombinantti-ACE2:n terapeuttisista vaikutuksista kokeellisessa maksafibroosissa, jossa maksavaurio aiheutettiin kirurgisesti kolestaasilla tai hepatotoksisella hiilitetrakloridi-injektiolla . He osoittivat, että rekombinantti ACE2 vähensi merkittävästi maksan fibroosia molemmissa maksasairauden eläinmalleissa . Tämän systeemisen lähestymistavan suurimpana haittana on kuitenkin se, että hoito aiheuttaa väistämättä off-target-vaikutuksia, jotka ovat monissa tapauksissa ei-toivottuja. Näin ollen rekombinantti-ACE2:n systeemiseen antoon liittyy useita haittoja. Niihin kuuluvat ACE2:n päivittäiset injektiot, mikä on kliinisessä ympäristössä invasiivinen ja kallis menetelmä, jolla on ei-toivottu vaikutus verenpaineen säätelyyn . Tämän ongelman välttämiseksi ihanteellinen lähestymistapa olisi lisätä kudospesifisiä ACE2-tasoja kohde-elimessä. Näin ollen elinspesifisen ACE2-aktiivisuuden lisäämisen maksaspesifisellä rekombinantti-AAV-vektorilla odotetaan tuottavan terapeuttisia vaikutuksia, jotka rajoittuvat kohde-elimeen, ja samalla minimoitavan ei-toivotut off-target-vaikutukset.

Maksaspesifisen kapsidiseerotyypin käytön lisäksi spesifisyyttä voidaan parantaa edelleen suunnittelemalla vektori, jossa ACE2-geeni on vahvan maksaspesifisen promoottorin, apolipoproteiini E:n/ihmisen α1-antitrypsiinin, transkriptionaalisessa valvonnassa. Laboratoriomme julkaisemissa tutkimuksissa käytettiin pseudotyypillistä maksaspesifistä AAV-vektoria (rAAV2/8) prekliiniseen arviointiin, ja niissä havaittiin, että hiirille annostellun hiiren ACE2-geenin maksan yliekspressio kesti jopa 6 kuukautta yhden vatsansisäisen injektion jälkeen. Tämän jälkeen hoidimme hiiriä erilaisilla maksasairausmalleilla, joihin kuuluivat sappiteiden ligatoinnin (BDL) aiheuttama sappitiefibroosi, hiilitetrakloridin (CCl4) injektioiden aiheuttama toksinen vaurio ja rasvamaksaan liittyvä maksafibroosi, joka aiheutui metioniini- ja koliinipuutteisen (MCD) ruokavalion ruokkimisesta rAAV2/8-ACE2:n kertaluonteisella vatsaontelonsisäisellä injektiolla . Hoito aiheutti ACE2:n ilmentymisen ja proteiiniaktiivisuuden merkittävän lisääntymisen, joka rajoittui maksaan vaikuttamatta muihin tärkeisiin elimiin. Toisin kuin perinnöllisissä sairauksissa, esimerkiksi hemofilia B:ssä, jossa suhteellisen alhainen transgeenin ilmentymistaso maksassa voi riittää veren FIX-pitoisuuksien pieniin nousuihin, ei-perinnöllisissä sairauksissa terapeuttiseen interventioon tarvittavan transgeenin ilmentymisen suuruus voi olla huomattavasti suurempi. Tämä puolestaan voi olla haaste geeniterapian tutkijoille. Mielenkiintoista on kuitenkin se, että rAAV2/8-ACE2:lla toteutetussa maksalle kohdennetussa terapiassa havaitsimme, että maksan ACE2:n lisääntynyt ilmentyminen vähensi profibroottisen Ang II:n määrää maksassa yli 50 prosenttia verrattuna niihin, joita hoidettiin ihmisen seerumin albumiinia sisältävällä kontrollivektorilla (rAAV2/8-HSA). Ang II:n väheneminen, johon liittyi antifibroottisen Ang-(1-7)-peptidin maksan tasojen nousu, johti tulehdussytokiinien ilmentymisen huomattavaan vähenemiseen, mikä johti maksan fibroosin syvään vähenemiseen kaikissa kolmessa mallissa (kuva 2) . Nämä lyhytaikaisilla eläinmalleilla tehdyt tutkimukset on validoitu edelleen, jotta saataisiin näyttöä siitä, että pitkäaikaisissa sappitiefibroosin ja rasvamaksasairauden eläinmalleissa, jotka tuottavat maksavaurioita, jotka ovat vertailukelpoisempia kuin kyseisiä sairauksia sairastavilla potilailla havaitut vauriot, rAAV2/8-ACE2:n yksittäinen vatsansisäinen injektio aiheutti maksafibroosin syvällisen vähenemisen (kuva 3). Toisin kuin muissa AAV-vektoreita käyttävissä tutkimuksissa, havaitsimme, että rAAV2/8-ACE2 alensi seerumin alaniinitransaminaasipitoisuuksia (ALT) sairastuneissa eläimissä verrattuna niihin eläimiin, jotka saivat vertailuvektorin (rAAV2/8-HSA), mikä viittaa siihen, että vektori itsessään on turvallinen maksassa. Lisäksi terveisiin hiiriin ruiskutettu rAAV2/8-HSA (enintään 10 päivää) tai rAAV2/8-ACE2 (enintään 24 viikkoa) -vektori ei aiheuttanut muutoksia plasman ALT-tasoissa, mikä vahvistaa, että vektori itsessään ei todennäköisesti aiheuta maksavaurioita. Kaavamainen esitys molekyylimekanismista, joka liittyy ACE2-geenihoitoon rAAV2/8-vektorilla maksafibroosissa, on esitetty kuvassa 4.

Maksuun kohdistettu geeninsiirto rAAV2/8-vektorilla on osoittautunut terapeuttisesti lupaavaksi aikuisten maksassa, mutta niiden vaikutuksia ei ole tutkittu laajasti epäkypsässä maksassa. Vaikka rAAV2/8 transdusoi vastasyntyneen hiiren maksan suurella tehokkuudella, vektori ei ole pysyvä maksassa ja heikkenee nopeasti maksan kasvun myötä. Siksi rAAV2/8-välitteisen hoidon menestyksekäs käyttö varhaislapsuuden maksasairauksien hoidossa saattaa vaatia uudelleenkäytön . Tämän mukaisesti eräässä toisessa tutkimuksessa osoitettiin, että ornitiinitranskarbamylaasi (OTC)-puutteisten vastasyntyneiden hiirten hoito AAV2/8-OTC-hoidolla ei suojannut hiiriä hyperammonemialta aikuisiässä . Näin ollen vakaan transduktion aikaansaaminen kehittyvässä maksassa on edelleen yksi maksaspesifisen rAAV2/8-geeniterapian suurimmista haasteista, ja vektoreiden uudelleen antaminen voi olla tarpeen terapeuttisen tehon säilyttämiseksi aikuisuudessa varhaisen neonataalisen hoidon jälkeen.

Vaikka prekliinisissä tutkimuksissa käytetyt AAV-vektorit voivat olla tehokkaita ihmisen maksassa, on tärkeää valita ihmisen hepatosyyteille spesifinen AAV-vektori, jolla on parannettu transduktion tehokkuus . Kaksi ryhmää on hiljattain ehdottanut humanisoitujen hiirten, kuten immunosuppressoidun FRG-hiirimallin (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-), käyttämistä parhaan rAAV-serotyypin tunnistamiseksi maksan suuntaamaa geeniterapiaa varten . Tutkimukset humanisoidulla hiirimallilla, jossa on yli 25 prosenttia ihmishepatosyyttejä, antoivat tutkijoille mahdollisuuden tunnistaa ihmismaksalle spesifisiä AAV-vektoreita, kuten LK-03, joka on johdettu kapsidi-DNA:lla sekoitetusta AAV-kirjastosta. Tämä kirjasto luotiin käyttämällä 10 AAV-kapsidigeeniä. LK-03, joka koostuu viidestä eri vanhempien AAV-kapsidista, pystyi transduktoimaan ihmisen primaarisia hepatosyyttejä suuremmalla tehokkuudella in vitroja hepatosellulaarisen karsinooman ksenotransplantaattimallissa in vivoverrattuna AAV-serotyyppiin 8 . Wang ja kollegat raportoivat myös korkeammasta maksan transduktiotasosta FRG-hiirillä käyttäen AAVrh10:n kapsidia, joka on Rhesusmakakista peräisin oleva E-klaadin AAV, ja AAV3B:tä, ja ovat osoittaneet, että AAV-LK-03-vektorit voivat olla parempia kuin AAV3B tai AAV8 . On odotettavissa, että tutkijat käyttävät yhä useammin humanisoituja eläinmalleja muihin sairauksiin kuin maksasairauksiin, jolloin he voivat tunnistaa muunneltujen AAV-vektoreiden uusia variantteja, transduktiotehokkuutta ja tutkittavalle ihmiskudokselle ominaisia immuunireaktioita. Lisäksi on raportoitu, että AAV3B-eGFP-vektori, joka pystyi aiheuttamaan maksaspesifistä vankkaa GFP-ekspressiota kädellisten maksassa, on huomattavasti parempi kuin AAV8 ilman ilmeistä maksatoksisuutta .

.