Proteiinien on oltava vuorovaikutuksessa toisten proteiinien kanssa muodostaakseen toiminnallisia komplekseja. Monissa tapauksissa proteiinien toimintaa solun sisällä ei voida ymmärtää ilman tietoa proteiinin rakenteesta ja tietoa siitä, missä kompleksissa proteiini sijaitsee.1, 2 Tämä on ensiarvoisen tärkeää esimerkiksi DNA:n epigeneettistä informaatiota muokkaavien proteiinien kohdalla. Lähes kaikki nämä kromatiinia muokkaavat proteiinit tarvitsevat intensiivistä vuorovaikutusta metabolisten entsyymien kanssa, jotka tuottavat histonien asetylaatioon, deasetylaatioon tai metylaatioon ja demetylaatioon tarvittavia kofaktoreita.3-5 Tämä osoittaa tarpeen tutkia tietyn proteiinin monimutkaista ympäristöä, jotta voidaan analysoida sen toimintaa ja aktiivisuustilaa. Proteiinien ristisilloittaminen yhdistettynä massaspektrometriseen analyysiin (XL-MS) soveltuu erinomaisesti menetelmäksi, jolla saadaan tietoa proteiinien rakenteesta ja proteiinikompleksien koostumuksesta.6-9 XL-MS:ää varten tarvitaan erikoistuneita kemiallisia reagensseja, ristisilloittajia, jotka kykenevät yhdistämään kovalenttisesti proteiinijäännöksiä, jotka ovat lähekkäin ja ovat vuorovaikutuksessa keskenään esimerkiksi kompleksissa.10, 11 Ristisilloitettujen peptidien karakterisointi massaspektrometrin avulla on kuitenkin melkoinen haaste kahdesta syystä. Ensinnäkin ristisidosten tunnistaminen on tehtävä analysoimalla fragmentti-ioneja ei vain yhdestä vaan kahdesta yhdistetystä peptidistä, mikä monimutkaistaa MS2-spektriä huomattavasti. Toiseksi ristisilloittuneita peptidilajeja on vain hyvin vähän, ja ne ovat osa peptidiseosta, jota hallitsevat ylivoimaisesti ristisilloittumattomat peptidit. Monissa tapauksissa tämä johtaa dramaattiseen informaatiohäviöön, joka vaikeuttaa ristisidosten tarkkaa tunnistamista ja siten interaktomianalyysiä. Näiden ongelmien ratkaisemiseksi kehitettiin muutamia ristisilloitusreagensseja, joissa otettiin käyttöön MS:llä pilkkoutuvia ryhmiä ja mahdollisuus XL-rikastamiseen.12-18

Tässä raportoimme uuden ristisilloitusreagenssin kehittämisestä, joka on rikastettavissa ja jolla on pilkkoutumisominaisuuksia, jotka mahdollistavat tarkan ristisilloituksen tunnistamisen. Suunniteltu cliXlink (1) on esitetty kuvassa 1. Soluja läpäisevässä reagenssissa (kuva 1 A ja kuva S1 tukitiedoissa) on kaksi sukkinimidyyliesteriyksikköä, jotka voivat reagoida proteiineissa olevien nukleofiilien kanssa ja jotka ovat noin 9 Å:n etäisyydellä toisistaan; näin mahdollistetaan lyhyiden etäisyyksien fiksaatio proteiinien rakennetiedon saamiseksi ja proteiinien vangitseminen toistensa läheisyydessä. Tehokkaan MS-hajautettavuuden takaa vakiintunut sulfoksidiryhmä, joka voidaan pilkkoa matalaenergisissä törmäysindusoidun dissosiaation (CID) olosuhteissa ennen peptidin fragmentoitumista. Lisäksi alkyniyksikkö mahdollistaa rikastusosan, esimerkiksi biotiinin, kiinnittämisen ristisilloituskohtiin CuAAC-reaktion avulla.19

Ristisilloitusaineen käyttö voi noudattaa kuvassa 1 B esitettyä työnkulkua. Siinä reagenssia 1 lisätään kompleksiseen proteomiin, jolloin lähekkäin olevien peptidien natiivitilan etäisyystieto kiinnittyy ja säilyy MS-analyysiä varten tehtävän myöhemmän työvaiheen ajan. Rikastusta varten tarvittavan affiniteettiryhmän kiinnittäminen suoritetaan ristisilloituksen jälkeen, jotta vältetään tilaa vievien rikastusryhmien aiheuttamat häiriöt. Muokkaamalla ristisilloitettuja peptidejä proteiinitasolla ylimääräiset pienimolekyyliset reagenssit voidaan helposti poistaa asetonisaostuksella. Tätä seuraa proteiinien entsymaattinen pilkkominen. Ristisilloitetut peptidit merkitään tällä tavoin esimerkiksi biotiinilla, mikä mahdollistaa niiden rikastamisen. Tämän jälkeen ne analysoidaan massaspektrometrisesti. Koska ristisidoksen yksittäisten peptidien massat eivät ole välittömästi saatavilla, ristisidoksen määrittäminen on vaikeaa erityisesti monimutkaisissa näytteissä. Tämän vuoksi on käytettävä MS-spektroskopiassa pilkkoutuvia reagensseja, jotka helpottavat MS2-tunnistusta muodostamalla spesifisiä fragmentti-ioneja.20, 21 Parhaimmillaan reagenssin pitäisi mahdollistaa myös MS3-kokeet, mikä edellyttää, että ristisilloittaja pilkotaan ennen peptidejä. Näin peptidit voidaan erottaa toisistaan MS3-pohjaista yksilöllistä tunnistusta varten. Reagenssimme 1 sisältää β-vetyatomeja sulfoksidin molemmin puolin, joten fragmentoituminen tapahtuu kahteen suuntaan, kuten kuvassa 1 C on esitetty. Tämä johtaa peptidien puhtaaseen erotteluun (α, β) ja tuottaa kaksi fragmenttia kullekin peptidille: alleeni- ja sulfiinihappofragmentin; jälkimmäisestä muodostuu tiiaali veden hävitessä. Näin saadaan kaksi massaparia, joilla on tunnusomainen Δm/z≈32. Tärkeää on, että havaitsimme, että fragmentaatiopolku a (kuva 1 C) oli vallitseva. Näin ollen α-peptidin osalta alkeenifragmentti ja β-peptidin osalta tialifragmentti ovat tärkeimmät pilkkoutumistuotteet. Epäsymmetristen pilkkoutumisominaisuuksien vuoksi suurin osa signaalin intensiteetistä säilyy yhdessä peptidikohtaisessa fragmentissa, minkä pitäisi tarjota erinomainen herkkyys MS3-kokeissa.

Reagenssin 1 synteesi on suoraviivainen (kaavio 1). Lähtökohtana on homokysteiini 2:n hapettunut disulfididimeeri, joka käsitellään 4-pentynoehapolla, jolloin saadaan disulfidi 3. Disulfidin reduktiivinen pilkkominen ja syntyneiden tiolien alkylointi metyyli-3-bromipropionaatilla tuottaa sulfidiyhdisteen 4. Molempien metyyliestereiden saponointi 5:ksi ja 5:n muuntaminen aktivoiduksi bissukkinimidyyliesteriksi 6, jota seuraa tioeetterin hapettuminen sulfoksidiksi, antaa reagenssin 1, jonka kokonaistuotos on 16 %. Erityisen tärkeää on, että reagenssi on erittäin puhdas ja että reaktiiviset esteriyksiköt ovat paikoillaan molemmilla puolilla. Osittaista hydrolyysiä on vältettävä. Tämä varmistettiin lopullisella saostuspuhdistuksella. Reagenssi 1 liuotettiin etyyliasetaatin ja dikloorimetaanin seokseen ja saostettiin lisäämällä heksaania.

Tutkimme seuraavaksi 1:n MS-ominaisuuksia. Tätä varten lisäsimme 1:n yleisesti käytettyyn malliproteiiniin, naudan seerumin albumiiniin (BSA). Noudatimme kuvassa 1 B esitettyä työnkulkua suorittamatta rikastusvaihetta. Lyhyesti sanottuna sen jälkeen, kun 1 oli lisätty proteiiniliuokseen ja reaktio oli kestänyt 1 tunnin huoneenlämmössä ja fysiologisessa pH:ssa, saostimme proteiinin asetonilla, suspendoimme sen uudelleen puskuriin (ks. tukitiedot) ja pilkkosimme proteiinin tämän jälkeen trypsiinin ja Lys-C:n seoksella.

Tuloksena saatu peptidiseos suolanpoistettiin C18 Tip-kolonnilla ja analysoitiin HPLC-MS2:n avulla (kuva 2). Kuvassa 2 A on esimerkkinä kaksi ristisilloitettua BSA-peptidiä (α+β). Kun olimme määritelleet ehjän ristisilloituksen tarkan massan (m/z 677,1; kuva 2 B), suoritimme sekä CID- että HCD-fragmentoinnin esiasteelle fragmentointiominaisuuksien arvioimiseksi (kuva 2 C). Selektiivisempi CID-fragmentointi (ristisidoksen ionin resonanssiheräte; kuva 2 C, ylin spektri) alhaisella 25 prosentin normalisoidulla törmäysenergialla tuottaa odotetusti vain pienen joukon voimakkaita signaaleja. Kaksi merkittävää signaaliparia, joiden Δm/z on 32 (Δmrep), saadaan ristisilloittajan fragmentaatiosta, jonka tuloksena jokaisesta peptidistä muodostuu tiali- (α-/β-tiali) ja alkeenifragmentti (α-/β-aleeni). Kuten edellä mainittiin, fragmentaatiopolku a (kuva 1 C) on ensisijainen, mikä johtaa epäsymmetriseen intensiteettijakaumaan. Odotettujen ehjien, erotettujen peptidien hallitseva muodostuminen tekee reagenssista soveltuvan kehittyneempiin MS3-kokeisiin.

Tutkimuksessamme käytimme HCD-fragmentointia. Tällä menetelmällä saadaan aikaan samanaikainen ristisidoksen pilkkoutuminen ja tunnistamiseen tarvittavien peptidifragmenttien muodostuminen (kuva 2 C, alaspektri). Ristisidoksen/peptidin tunnistamisen helpottamiseksi on tärkeää, että HCD-fragmentointi tuottaa edelleen alkeeni- ja tiaalifragmentteja. HCD-tiedot mahdollistavat siis peptidien tunnistamisen MS2:n avulla. Lisäksi kuvasimme BSA:n kiderakenteesta löydetyt ristisidokset ja totesimme, että suurin osa mitatuista etäisyyksistä oli kohtuullisia. Tärkeää on, että ristikytkentöjen keskimääräinen Cα-Cα-etäisyys ristikytkettyjen aminohappojen välillä on 22,1 Å ja etäisyysjakauma vastaa täysin sitä, mitä odotetaan ristikytkennältä, joka tehdään reagenssilla, jossa aktiiviset esterit ovat noin 9 Å:n etäisyydellä toisistaan (kuvat 2 E ja S2)26 ja jossa otetaan huomioon sivuketjujen pituudet ja proteiinien molekyylidynamiikka.27 Ristisilloittuminen tapahtui enimmäkseen kahden Lys-jäännöksen välillä (49 %), mutta havaitsimme myös Lys-Thr- (30 %), Lys-Ser- (13 %) ja Lys-Tyr- (8 %) yhteyksiä, mikä on sopusoinnussa sukkinimidyyliestereiden reaktiivisuuden kanssa (kuva 2 F).28

Tämän onnistumisen ansiosta pystyimme validoimaan uuden ristisilloitusaineen monimutkaisemmassa ympäristössä. Halusimme erityisesti osoittaa CuAAC-pohjaisen rikastusmahdollisuuden lisäarvon. Tätä koetta varten ristisilloitimme jälleen BSA-proteiinin (10 μg), saostimme sen asetonilla, liuottelimme ristisilloitetun proteiinin uudelleen ja suoritimme sen jälkeen klikkausreaktion (kuva S3 A) lisäämällä 7 (kuva 3 A) ja CuSO4/tris(3-hydroksipropyylitriatsolyylimetyyli)amiinia (THPTA) ja sen jälkeen pelkistämällä CuII CuI:n CuI:ksi, kun siihen lisättiin natriumaskorbaattia. Kun 1 h oli kulunut huoneenlämmössä, suoritettiin toinen asetonisaostus ylimääräisen biotiiniasidin poistamiseksi. Tämän jälkeen lisäsimme trypsiiniä ja Lys-C:tä pilkkomista varten.

Nämä peptidit yhdistettiin seuraavaksi HEK-soluuutteesta saatuun proteiinidigestiin (435 μg proteiinia; kuva 3 B). Tämä luo massiivisen taustan ristisilloittumattomille peptideille. Jos nyt analysoimme ristikytkentöjä tämän suuren taustan sisällä (kuva 3 C), tunnistimme vain hyvin pienen määrän ristikytkentöjen spektrisiä vastineita (keskimääräinen CSM = 5,0), ainutlaatuisia ristikytkentäkohtia (keskimääräinen yksilöllinen XL = 3,7) sekä monolinkeja (keskiarvo = 5,3), joissa yksi sukkinimidyyliesteri hydrolysoitui ennen reaktiota proteiinin kanssa. Jos rikastus kuitenkin suoritettiin streptavidiinilla päällystetyillä magneettihelmillä, ristisidosten tunnistusten määrä parani huomattavasti. Kun peptidiseosta oli inkuboitu magneettihiukkasten kanssa, helmiä oli pesty laajasti (6×) puskurilla (ks. tukitiedot) ja disulfidia oli pilkottu miedosti reduktiivisesti ”vangittujen” ristisidosten vapauttamiseksi ja siten biotiiniryhmän poistamiseksi (kuva S3 B), havaitsimme nyt keskimäärin 95,0 CSM:ää ja 37,0 yksilöllistä XL:ää yhdessä 184,3:n monoliinin kanssa. Tunnistettujen yksilöllisten XL:ien määrä oli pienempi kuin puhdistetun BSA:n osalta (kuva 2 D), mikä voisi selittyä CuAAC-reaktion tehottomuudella tai ristisilloittumattoman kompleksin taustan häiritsevyydellä. Tämä tulos osoittaa kuitenkin, että uusi ristisilloitusaineemme 1 pystyy rikastamaan ristisilloitettuja peptidejä modifioimattomien peptidien suureen ylimäärään, mikä helpottaa sellaisten kompleksinäytteiden analysointia, joissa on vähän ristisilloituksia. Alun perin suhtauduimme epäilevästi 1:n epäsymmetriseen rakenteeseen. Tiedot osoittavat kuitenkin, että siitä huolimatta suuri määrä ristisidoksia tunnistetaan.

Yhteenvetona voidaan todeta, että uudessa ristikytkentäaineessamme 1 yhdistyvät seuraavat edut: ensinnäkin reagenssin koko soveltuu erinomaisesti arvokkaan etäisyysinformaation saamiseen rakenneproteomiikkaa varten. Lisäksi molekyyli on solun läpäisevä, eikä alkyniyksikkö aiheuta merkittäviä häiriöitä ristisilloitusreaktiossa. Lisäksi vankka ja tehokas sulfoksidifragmentaatio helpottaa ristisilloituksen tunnistamista. Mahdollisuus funktionalisoida 1:llä ristisilloitettuja peptidejä klikkauskemian avulla mahdollistaa erilaisten modifikaatioiden ja rikastusstrategioiden käytön, jotka mahdollistavat vähän esiintyvien ristisilloitusten analysoinnin. Yhteenvetona voidaan todeta, että reagenssimme 1 tasoittaa nyt tietä monimutkaiselle interaktomianalyysille MS2- ja MS3-kokeiden avulla.

Eturistiriita

Tekijät eivät ilmoita eturistiriitoja.