Die Geschlechtschromosomen von Säugetieren spielen eine besondere Rolle bei der Entwicklung männlicher (XY) und weiblicher (XX) Keimzellen (1). Anomalien der Geschlechtschromosomen sind die häufigste genetische Ursache für menschliche Unfruchtbarkeit (2). Bei den Geschlechtschromosomen-Trisomien (SCTs) Klinefelter- (XXY) und Doppel-Y-Syndrom (XYY) ist die Spermatogenese durch einen Überschuss an X- bzw. Y-Genen gestört (2). XYY-Männer sind in der Regel aufgrund des spontanen Verlusts des zusätzlichen Geschlechtschromosoms (Mosaizismus) fruchtbar. Bei XXY-Männern ist der Mosaizismus weniger häufig. Die testikuläre Spermagewinnung hat bei einigen jungen Klinefelter-Männern eine Reproduktion ermöglicht, ist aber bei älteren Patienten weniger erfolgreich (3, 4). XXY- und XYY-Personen ohne XY-Keimzellen sind unfruchtbar.

Um die SCT-Unfruchtbarkeit zu untersuchen, haben wir erwachsene XXY- und XYY-Mäuse erzeugt, die die fluoreszierenden Reporter-Transgene Blimp1-mVenus (BV) und Stella-ECFP (SC) (5) tragen, um die Differenzierung pluripotenter Stammzellen in primordiale keimzellähnliche Zellen (PGCLCs) (6) zu überwachen. XXY-Männchen wurden durch die Paarung eines Wildtyp-Weibchens mit einem männlichen Geschlechtschromosom-Varianten-Mann erzeugt, der XY-haltige Spermien produziert (Abb. S1). Die Erzeugung von XYY-Mäusen erfordert die Vererbung eines Y-Chromosoms von beiden Elternteilen. Wir verwendeten daher ein väterlicherseits vererbtes Wildtyp-Y-Chromosom und ein mütterlicherseits vererbtes Yd1-Chromosom, das den Hodenbestimmungsfaktor Sry nicht exprimiert (Abb. S1) (7). Wie bereits früher gezeigt (8, 9), entsprach der Phänotyp der Spermatogenese in beiden Modellen dem von SCT-Männern, wobei die Spermatogenese bei XXY-Mäusen im Prospermatogonalstadium und bei XYY-Mäusen im Pachynema zum Stillstand kam (Abb. S2). Die Spermatogenese war bei euploiden XY BVSC transgenen Geschwistern normal.

Als nächstes etablierten wir Fibroblasten von SCT- und Kontroll-XY- und XX-Mäusen (Abb. 1A). Die DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (DNA-FISH) für das X-Gen Slx und das Y-Gen Sly bestätigte, dass SCT- und Kontrollfibroblasten der Passage 4 (P4) ihre ursprünglichen Geschlechtschromosomenkomplexe behalten hatten (Abb. 1B und Abb. S3A). Fibroblasten wurden auf Doxycyclin (Dox)-induzierbare Weise zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) (10) umprogrammiert. DNA-FISH wurde in den resultierenden P2 iPSCs durchgeführt (Abb. 1A).

Ein hoher Anteil der SCT-abgeleiteten iPSC-Linien wies einen Geschlechtschromosomenverlust auf. Bei XXY-Mäusen beobachteten wir XY-, XX- und XO-iPSCs (Abb. 1, C und E). Die Häufigkeit des Verlusts war für die X- und Y-Chromosomen ähnlich (P = 0,062, Mann-Whitney-Test). Bei XYY-Mäusen beobachteten wir XY- und XO-iPSCs (Abb. 1, D und E). Der Verlust des Y-Chromosoms bei XYY-Männchen trat mit einer ähnlichen Häufigkeit auf wie der Verlust des X- und Y-Chromosoms bei XXY-Männchen zusammen (P = 0,089, Mann-Whitney-Test). Anschließend verglichen wir die Häufigkeit des Verlusts von Geschlechtschromosomen zwischen SCT- und euploiden XY- und XX-abgeleiteten iPSCs. Der Verlust von Geschlechtschromosomen war bei SCTs häufiger als bei euploiden iPSCs (Abb. 1E), unabhängig davon, welcher Grenzwert zur Definition des Verlusts von Geschlechtschromosomen verwendet wurde (Abb. S12D).

Der Verlust von Geschlechtschromosomen könnte während der Reprogrammierung von SCT-Zellen oder während der Vermehrung von iPSCs zu P2 auftreten und den daraus resultierenden euploiden Zellen möglicherweise einen Proliferationsvorteil verschaffen. In der Tat wurde eine Instabilität der Geschlechtschromosomen bei pluripotenten Stammzellen beobachtet (11, 12). Um die letztgenannte Hypothese zu testen, haben wir die Stabilität der Geschlechtschromosomen zwischen P2 und P6 in iPSCs mit hochgradig elterlichen (>90%) Ergänzungen analysiert (Abb. S4A). Wir beobachteten den Verlust von Geschlechtschromosomen in XX- und XXY-iPSC-Linien (P < 0,01 bzw. 0,05; Wilcoxon signed-rank test), aber nicht in XY- und XYY-iPSC-Linien (P = 0,21 bzw. 0,66; Wilcoxon signed-rank test). Keine iPSC-Linie wies jedoch einen Rückgang des elterlichen Komplements um mehr als 15 % auf (Abb. S4B). Darüber hinaus war der Verlust von Geschlechtschromosomen zwischen P2 und P6 nicht trisomie-abhängig (Abb. S4B). SCT-abgeleitete euploide XY-iPSCs wiesen auch keinen Proliferationsvorteil gegenüber XXY- oder XYY-iPSCs auf (Abb. S5). Da SCT-Fibroblasten auch karyotypisch stabil waren (Abb. 1B und Abb. S3A), wird der Chromosomenverlust wahrscheinlich während der iPSC-Reprogrammierung induziert und unterscheidet sich somit von der Instabilität der Geschlechtschromosomen in pluripotenten Stammzellen (11, 12). Wir bezeichnen das Phänomen als trisomiebedingten Chromosomenverlust (TCL).

Als nächstes untersuchten wir, ob euploide XY-iPSCs aus SCT-Fibroblasten funktionelle Spermien bilden würden. Wir wählten hoch euploide (≥80% der Zellen XY) P6 iPSCs, die an Dox-freies Medium angepasst waren (Abb. S6). Für unsere XYY-Experimente wurden nur XY iPSC-Linien, die das Wildtyp-Y-Chromosom und nicht das Yd1-Chromosom enthielten, für PGCLC-Experimente verwendet (Abb. S7). Die Karyotypisierung bestätigte, dass alle SCT-abgeleiteten XY-iPSC-Linien und eine XY-iPSC-Kontrolllinie euploid waren (Abb. S8). Diese iPSC-Linien wurden durch einen epiblastenähnlichen Zustand differenziert (6), um PGCLC-Aggregate zu erzeugen, die positiv für BV und SC waren (Abb. 2A). BV-positive PGCLCs (Tabelle S1) wurden durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert (Abb. 2B) und in keimzelldefiziente W/Wv (Kit-Mutante) Hoden transplantiert (13).

Die Spermatogenese bei den Empfängern wurde 9 bis 10 Wochen nach der Transplantation untersucht. Teratome, die nach der Transplantation von iPSC-abgeleiteten PGCLC beobachtet werden (6), waren bei 29 % der XXY-abgeleiteten und 50 % der XYY-abgeleiteten transplantierten Linien vorhanden (Abb. S9). Die Rekonstitution der Spermatogenese, die durch das Vorhandensein von spermatogenen Kolonien (Abb. 2C) und durch die Histologie (Abb. 2D) nachgewiesen werden konnte, wurde für alle verwendeten XXY- und XYY-abgeleiteten iPSC-Linien beobachtet (Tabelle 1). Somit können aus SCT abgeleitete XY iPSCs in vitro zu Keimzellen differenzieren und die Spermatogenese nach der Transplantation abschließen.

Wir wollten wissen, ob durch Transplantation erzeugte Spermien die Fortpflanzung unterstützen können. Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) mit Spermien von zwei XXY- und zwei XYY-abgeleiteten XY iPSC-Linien (Abb. 2E und Abb. S10A) erzeugte Zygoten, die sich in vitro zu zweizelligen Embryonen entwickelten (Effizienz 76.7 bis 87,3 %) (Abb. 2F, Abb. S10B und Tabelle S2) und völlig normale Nachkommen bei der Transplantation in Empfänger (Effizienz 46,9 bis 59,4 %) (Abb. 2G, Abb. S10C und Tabelle S2). Die Genotypisierung mittels Polymerase-Kettenreaktion bestätigte, dass die Nachkommen von den transplantierten PGCLCs abstammten (Abb. S10D). Welpen aus XXY- und XYY-abgeleiteten iPSC-Linien zeigten ein vergleichbares Wachstum wie die aus XY-iPSC-Kontrolllinien abgeleiteten (Abb. S10E). Bemerkenswert ist, dass die XXY- und XYY-Welpen euploide (XY oder XX) Ergänzungen hatten (Abb. S11). Drei reife Männchen und drei Weibchen aus jeder XXY- und XYY-abgeleiteten iPSC-Linie wurden miteinander verpaart, und alle waren fruchtbar (Abb. 2H und Abb. S10F). Somit erzeugen Spermien aus SCT-abgeleiteten XY-iPSCs chromosomal normale, gesunde und fruchtbare Nachkommen.

Wir untersuchten, ob TCL spezifisch für Trisomie der Geschlechtschromosomen ist. Da Mausmodelle mit Trisomie für ein komplettes Autosom nicht verfügbar sind (14), wiederholten wir unsere Experimente an männlichen Tc1-Transchromosom-Mäusen, einem Down-Syndrom-Modell mit einem akzessorischen menschlichen Chromosom 21 (hChr.21) (15). Tc1-Mäuse tragen eine in hChr.21 eingefügte Neomycin-Resistenzkassette, deren Selektion den hChr.21-Mosaizismus reduziert (15). Daher haben wir zunächst erwachsene Tc1-Fibroblasten mit dem Neomycin-Analogon G418 auf das Vorhandensein von hChr.21 angereichert (Abb. 3A). DNA-FISH zeigte, dass die große Mehrheit (≥96 %) der Tc1-Fibroblasten hChr.21 enthielt (Abb. 3B und Abb. S3B). Diese Tc1-Fibroblasten wurden ohne G418-Selektion reprogrammiert, und die resultierenden iPSCs wurden bei P2 analysiert. Zehn der 16 erzeugten iPSC-Linien (62,5 %) wiesen einen Verlust von hChr.21 in ≥10 % der Zellen auf (Abb. 3, C und D, und Abb. S12D). Im Gegensatz dazu blieb hChr21 nach der Entfernung von G418 in Tc1-Fibroblasten erhalten, die für denselben Zeitraum kultiviert wurden wie die für die iPSC-Reprogrammierung verwendeten (18 Tage), sowie in P6-iPSC-Linien, die bei P2 hochgradig elterliche (>90% hChr.21-positive) Komplemente aufwiesen (Abb. S12, A und B). Wir schließen daraus, dass der Verlust von hChr.21 in Tc1-Zellen eher durch die Reprogrammierung als durch die Entfernung von G418 gefördert wird und dass TCL daher auch ein akzessorisches Chromosom betrifft.

Als nächstes fragten wir, ob TCL in menschlichen Zellen auftritt. Chromosomenverluste wurden bei der Kultivierung trisomischer menschlicher Zellen beobachtet (16, 17), aber ihre Prävalenz und ihr Zusammenhang mit der Reprogrammierung wurden nicht systematisch analysiert. Wir wählten menschliche Klinefelter-Syndrom-, Down-Syndrom- und euploide XY- und XX-Fibroblastenlinien mit minimalem Mosaizismus aus (Abb. S13, A und D), reprogrammierten sie und bestimmten die Chromosomenkomplemente der resultierenden iPSC-Linien. Wir beobachteten XY- und XX-iPSCs aus Klinefelter-Syndrom-Fibroblasten und euploide iPSCs aus Down-Syndrom-Fibroblasten (Abb. S13, B, C, F und G). Der Chromosomenverlust war in trisomischen Zellen häufiger als in disomischen Zellen, was zeigt, dass TCL auch bei der menschlichen Reprogrammierung auftritt. Die Häufigkeit der hoch euploiden iPSC-Linien war jedoch geringer als bei den aus Trisomien gewonnenen iPSCs von Mäusen (Abb. S13, F bis H).

Wir haben gezeigt, dass TCL euploide iPSCs aus SCT und autosomal trisomischen Mäusen und Patienten erzeugt (Abb. S12E). In Mäusen können die resultierenden „korrigierten“ iPSCs funktionale Spermien bilden, was die Produktion von chromosomal euploiden Nachkommen von unfruchtbaren SCT-Personen ermöglicht. TCL ergänzt die bestehenden iPSC-Therapien für Chromosomenanomalien (17-21). Die Mechanismen, die TCL verursachen, sind unbekannt. Zellulärer Stress, der mit der Reprogrammierung einhergeht, könnte gegen trisomische Zellen selektieren und so die Entstehung euploider Zellen ermöglichen. Bei menschlichen Zellen wurde TCL weniger häufig beobachtet als bei Mäusezellen (Abb. S12D und S13H). Selbst wenn TCL selten sind, könnten sie eine Behandlungsmöglichkeit für unfruchtbare SCT-Patienten darstellen, bei denen alternative Ansätze erfolglos sind. Die klinische Verwendung von in vitro hergestellten menschlichen Keimzellen sollte jedoch ethisch und rechtlich sorgfältig geprüft werden (22-24). Darüber hinaus muss eine vollständige In-vitro-Spermatogenese entwickelt werden, um das Risiko der Teratombildung durch Keimzelltransplantation zu vermeiden.

TCL ermöglicht auch die Herstellung weiblicher iPSCs aus männlichen Zellen, was die genetische Untersuchung von Geschlechtsdimorphismen ermöglicht (25). Durch die Erzeugung isogener iPSC-Linien, die sich nur in Bezug auf ihre Geschlechtschromosomen unterscheiden, könnten bei der Modellierung von iPSC-Krankheiten festgestellte Geschlechtsunterschiede auf X- oder Y-chromosomale Effekte zurückgeführt werden.