Resumen

El objetivo de este estudio fue investigar el papel de los ácidos orgánicos producidos por la cepa 12/1 de Exiguobacterium sp. (DSM 21148) en la neutralización de aguas residuales alcalinas procedentes de la industria de bebidas. Se sabe que esta bacteria es capaz de crecer en un medio de pH tan alto como 12,0 y de neutralizar aguas residuales industriales alcalinas de pH 12,0 a pH 7,5. La investigación inicial sobre el tipo de grupos funcionales presentes en el medio, realizada mediante espectroscopia FT-IR, reveló la presencia de picos correspondientes al grupo carbonilo y al grupo hidroxilo, lo que sugiere la liberación de ácido carboxílico o producto(s) metabólico(s) relacionado(s). La identificación del grupo carboxílico específico, realizada mediante RP-HPLC, reveló la presencia de un único pico en el sobrenadante del cultivo con un tiempo de retención muy similar al del ácido fórmico. Se estudió la concentración de ácido producido en diferentes fuentes de carbono en función del tiempo. Aunque el ácido estaba presente en la misma concentración final, la tasa de producción de ácido fue mayor en el caso del medio suplementado con sacarosa, seguido de la fructosa y la glucosa. El conocimiento de los productos metabólicos de la bacteria puede considerarse como un primer paso hacia la realización de su potencial para la biorremediación a gran escala de las aguas residuales alcalinas de la industria de bebidas.

1. Introducción

Los alcalifilos -microorganismos que tienen un pH óptimo de crecimiento igual o superior a pH 9- han tenido un gran impacto en las aplicaciones industriales. Los detergentes biológicos contienen enzimas, como celulasas alcalinas y/o proteasas alcalinas, que han sido producidas a partir de alcalifilos . Los alcalifilos también se han utilizado para la producción industrial de enzimas para que puedan tener un uso específico, por ejemplo, la ciclodextrina mediante la ciclomaltodextrina glucanotransferasa alcalina y la maltohexaosa activa alcalina formadora de α-amilasa, que encuentran aplicación en las industrias alimentaria, química y farmacéutica. Se ha informado de que la pulpa de madera tratada con álcali podría ser blanqueada biológicamente por las xilanasas producidas por los alcalifilos. Fujiwara y sus colaboradores han informado del uso de una proteasa alcalina para descomponer el revestimiento gelatinoso de las películas de rayos X, de las que se recuperó la plata. Los alcalifilos también han demostrado su potencial en la biodegradación de una variedad de compuestos orgánicos.

Así, las bacterias alcalifílicas han atraído mucho interés debido a sus enzimas extracelulares y a sus propiedades bioquímicas, como la alcalifilia y la estabilidad al álcali. También se ha investigado con cierto detalle su bioenergética, mientras que se conoce poco sobre su fisiología, por ejemplo, las enzimas y los metabolitos intracelulares. Las características del proceso metabólico intermedio son importantes, ya que ayudan a caracterizar la bacteria, su composición enzimática, la fase metabólica de las células y las posibilidades de ingeniería metabólica. La capacidad de los alcalifilos para hacer fluctuar fuertemente el pH del medio que contiene carbohidratos fue explotada en trabajos anteriores para la neutralización de aguas residuales altamente alcalinas procedentes de la industria de bebidas utilizando la cepa 12/1 de Exiguobacterium sp. El género Exiguobacterium pertenece al orden Bacillales que también incluye miembros del género Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 es un alcalípilo facultativo que crece de forma óptima a pH 10 y es capaz de neutralizar las aguas residuales alcalinas para bajarlas de pH 12,0 a pH 7,5. Se supone que la bacteria libera algún producto metabólico ácido para neutralizar el medio externo altamente alcalino. Sin embargo, es importante caracterizar el tipo de metabolitos liberados en el medio extracelular. Aquí estudiamos la producción de ácidos orgánicos como posible mecanismo de neutralización del álcali. Este tipo de estudios serán necesarios antes de poder desarrollar aplicaciones a gran escala de la bacteria para la neutralización de las aguas residuales alcalinas de la industria de bebidas.

La principal fuente de carbono en las aguas residuales de la industria de refrescos es la sacarosa (disacárido que contiene glucosa y fructosa), que es también el principal contribuyente a su demanda bioquímica de oxígeno (DBO) . La DBO media de las aguas residuales de la industria de refrescos oscila entre 600 y 4500 mg/L, lo que equivale a 673-5052 ppm de sacarosa. Un estudio bibliográfico de los productos metabólicos de un gran número de bacterias que crecen sobre azúcares simples sugiere que las bacterias podrían estar utilizando estos azúcares simples para generar ácidos orgánicos. Esto se ve corroborado por el análisis de los productos metabólicos extracelulares de otras especies de Bacillus alcalifílicos. El principal ácido orgánico producido en la fuente de carbono de la sacarosa en estos estudios resultó ser el ácido acético. El ácido fórmico es un metabolito común de las bacterias neutrófilas en condiciones anaeróbicas, mientras que B. circulans var. alkalophilus produce hasta 2 g/L del mismo incluso en cultivos aeróbicos. Otros ácidos volátiles como el propiónico, butírico, isobutírico e isovalérico son típicos de las cepas Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus y Bacillus sp. 17-1. Se ha informado de la presencia de ácidos isobutíricos e isovaléricos en los medios de varios bacilos neutrófilos. Pero se considera que estos ácidos, así como los ácidos propiónico y butírico, se originan a partir de aminoácidos basándose en estudios sobre Clostridium sp. . Los ácidos láctico y pirúvico son producidos con bastante frecuencia por bacilos neutrófilos , pero la producción de ácido succínico por Bacillus es rara . No se ha detectado etanol en los bacilos alcalifílicos aunque es un producto típico de los cultivos de glucosa de muchos bacilos neutrófilos . Por lo tanto, las condiciones de crecimiento alcalino pueden afectar a la producción de los metabolitos neutros. En este estudio hemos utilizado la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa para estudiar el tipo y la concentración de ácidos producidos por la cepa 12/1 de Exiguobacterium sp. durante la neutralización del medio de alto pH que contiene diferentes tipos de fuentes de carbono.

2. Materiales y métodos

2.1. Cepa y condiciones de cultivo

El cultivo de Exiguobacterium sp. 12/1 se obtuvo de DSMZ (DSM 21148) y se mantuvo como existencias de glicerol. Se utilizó un medio basal alcalino (ABM) que contenía (todas las concentraciones en g/L): peptona, 1; extracto de levadura, 0,5; glucosa, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (los tres últimos componentes se añadieron al medio esterilizado en autoclave a partir de soluciones esterilizadas por separado) para el cultivo rutinario de la cepa 12/1 a 37°C. Para el análisis IR y RP-HPLC, la bacteria se cultivó a 37°C, 200 rpm en un medio salino mínimo (MSM) que contenía (todas las concentraciones en mM) K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; sal disódica EDTA, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 y 1% (p/v) de uno de los siguientes carbohidratos: glucosa, fructosa o sacarosa (todos los componentes se añadieron a partir de las soluciones madre concentradas autoclavadas por separado). El pH final del medio se ajustó a 10,5 utilizando NaOH 1 N.

2,2. Análisis del crecimiento y del pH del cultivo

Se utilizó 1 mL de cultivo en fase logarítmica en ABM para inocular los precultivos (50 mL) (MSM con 1% de azúcar). El cultivo de prueba real (250 mL de MSM en un matraz Erlenmeyer de 500 mL) se inoculó con todo el precultivo en fase logarítmica media (D.O. ~ 1,2). Cada juego de cultivo constaba de tres frascos. La absorbancia de las muestras a 650 nm se utilizó como medida del crecimiento bacteriano. El pH se determinó en las muestras de cultivo libres de células a temperatura ambiente después de centrifugar a 4000 ×g durante 20 min.

2.3. Análisis FT-IR

El cultivo se cosechó tras 60 h de crecimiento y se centrifugó a 4000 ×g durante 20 min. Para el análisis IR, el sobrenadante del cultivo se liofilizó y se trituró en forma de polvo. El sobrenadante en polvo se mezcló con bromuro de potasio, y la mezcla se prensó en forma de tableta. Finalmente, el comprimido se analizó utilizando el espectrómetro FT/IR-4200 (JASCO, Tokio, Japón).

2.4. Análisis RP-HPLC

El cultivo se cosechó en diferentes puntos de tiempo y se centrifugó a 4000 ×g durante 20 min. Para el análisis por HPLC, el sobrenadante del cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22 μm, y se inyectaron 10 μL de muestra filtrada en la columna de HPLC.

El ácido fórmico, el ácido acético, el ácido succínico, el ácido propiónico, el ácido láctico y el ácido isobutírico de grado estándar analítico se obtuvieron de Sigma. Se prepararon soluciones estándar madre (100 mg/mL o 100 μL/mL) y se almacenaron a 4°C para su uso posterior. Se prepararon diariamente soluciones estándar de trabajo (10 mg/mL o 10 μL/mL). Se utilizó agua Milli-Q (Millipore) para preparar soluciones tampón y soluciones madre de cada compuesto y de las muestras. Las soluciones madre, las muestras y el tampón se filtraron a través de filtros de membrana de celulosa Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Los disolventes se desgasificaron al vacío antes de su uso.

El análisis de ácidos orgánicos se realizó según el método de Tormo e Izco . El análisis se llevó a cabo en un sistema Breeze (Waters, Mildford, MA, EE.UU.) que consistía en una bomba HPLC binaria 1525, un automuestreador 717 plus y un detector UV de dos canales 2487 ajustado a 210 nm, operado mediante un software Breeze. La separación se realizó en una columna Atlantis dC18 (Waters) de 250 × 4,6 × 5 μm. Se prepararon diariamente 20 mM de NaH2PO4 ajustados a pH 2,20 con ácido fosfórico y se filtraron a través de membranas hidrofílicas de 0,2 μm (Millipore). El programa de disolventes utilizó dos depósitos que contenían 1% de acetonitrilo en tampón fosfato 20 mM ajustado a pH 2,20 con ácido fosfórico (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B); el caudal se fijó en 1,5 mL/min a temperatura ambiente. El programa de gradiente comenzó con el 100% del disolvente A y después de 7 min se aumentó linealmente el disolvente B hasta alcanzar el 7% en 5 min. De 12 a 19 min la velocidad se mantuvo al 93% del disolvente A y al 7% del disolvente B. Después se cambió la velocidad a las condiciones iniciales para equilibrar la columna durante 15 min antes de inyectar de nuevo 10 μL de la siguiente muestra.

3. Resultados

3.1. Análisis de la neutralización en medio definido

Se seleccionó el medio de sal mínima para el análisis del ácido orgánico producido por la bacteria debido a su naturaleza definida y a la fuente de carbono similar a las aguas residuales de la industria de bebidas. La bacteria se dejó crecer en un medio de sal mínima complementado con diferentes fuentes de carbono: glucosa, fructosa y sacarosa. La figura 1 muestra el perfil de crecimiento y las características del pH del medio con el tiempo. La fructosa y la sacarosa produjeron una neutralización mucho más rápida del medio en comparación con la glucosa. El pH final obtenido con la glucosa también fue ligeramente superior al obtenido en el caso del medio suplementado con sacarosa y fructosa. Esto también se refleja en el perfil de crecimiento de la bacteria cultivada en las tres fuentes de carbono. La bacteria creció más rápidamente en sacarosa, seguida de fructosa y glucosa.

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3.2. Identificación del grupo funcional presente en el sobrenadante del cultivo

Para identificar el grupo funcional amplio del metabolito producido por la bacteria para neutralizar las aguas residuales alcalinas, el sobrenadante del cultivo liofilizado se sometió a espectroscopia FT-IR. Dos picos correspondientes al grupo carbonilo (a 1644,98 cm-1) y al grupo hidroxilo (a 3436,74 cm-1) estaban presentes en el espectro (Tabla 1). Según el estudio de la literatura, lo más probable es que la bacteria produzca ácidos orgánicos como producto metabólico que neutraliza las aguas residuales alcalinas.

3.3. Identificación del producto metabólico específico de la bacteria

Para identificar el ácido orgánico producido por la bacteria, se realizó una HPLC de fase inversa utilizando estándares de ácidos orgánicos conocidos seleccionados tras un estudio de la literatura. Los estándares se ejecutaron tanto individualmente (Figura 2(a)) como en mezcla (Figura 2(b)) con el fin de determinar cualquier diferencia en el tiempo de retención debido a la interferencia de otros ácidos orgánicos en el medio. Se comprobó que el RT de los ácidos orgánicos estándar en los dos casos era similar y que la diferencia en el tiempo de retención no superaba las 0,09 unidades, excepto para el ácido propiónico (Tabla 2). El sobrenadante del cultivo fue analizado por el mismo método y se encontró que comprendía un solo pico con un tiempo de retención similar al del ácido fórmico. Esto se confirmó además añadiendo al sobrenadante ácido fórmico estándar cuyo pico se superpuso con el del producto en el sobrenadante (Figura 2(d)).

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(c)
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3.4. Análisis cuantitativo del producto metabólico de la bacteria

Para el análisis cuantitativo del sobrenadante de cultivo, se corrieron diferentes concentraciones estándar de ácido fórmico, y se calculó el área del pico correspondiente a cada concentración. El área del pico se trazó frente a la concentración para obtener una curva estándar (Figura 3). Esta curva estándar se utilizó para calcular la cantidad de ácido producida con el tiempo en un medio salino mínimo suplementado con diferentes fuentes de carbono. El sobrenadante del cultivo de la bacteria se analizó en función del tiempo y se sometió de nuevo a un análisis de HPLC de fase inversa. Se encontró que el pico del producto principal en el sobrenadante del cultivo bacteriano aumenta con el tiempo. El tiempo de retención del ácido es similar al del ácido fórmico. El estudio del ácido fórmico producido con diferentes fuentes de carbono en función del tiempo se muestra en la Figura 4. La mayor cantidad de ácido se produjo en el caso del MSM suplementado con sacarosa, seguido de la fructosa y la glucosa.

Figura 3

Curva estándar para la determinación de la concentración de ácido fórmico en el sobrenadante del cultivo.

Figura 4

Variación de la cantidad de ácido orgánico producido con el tiempo en MSM suplementado con diferentes fuentes de carbono. Los valores representan la media de tres mediciones replicadas, y las barras de error representan la desviación estándar.

4. Discusión

La principal fuente de carbono en el efluente de las aguas residuales de la industria de bebidas es la sacarosa . Por lo tanto, para el análisis del producto metabólico producido durante la neutralización, se seleccionó un medio salino mínimo bien definido que contenía sacarosa y los dos azúcares monosacáridos constituyentes -glucosa y fructosa-. Las características de crecimiento de la cepa 12/1 en un medio salino mínimo complementado con las tres fuentes de carbono muestran una eficiente neutralización concomitante al crecimiento (Figuras 1(a) y 1(b)). La disminución del pH del medio de crecimiento se debe necesariamente a la formación de ácidos o a la eliminación de bases .

La producción de ácidos está bien documentada en el caso de las bacterias cultivadas con azúcares simples. Se han estudiado los productos metabólicos de algunos miembros alcalifílicos del género Bacillus . El principal ácido orgánico producido en la fuente de carbono de la sacarosa en estos estudios resultó ser el ácido acético. Las secuencias del genoma de las especies de bacilos alcalifílicos -Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans y Bacillus clausii- también apoyan esta observación, ya que todas estas especies tienen una vía funcional de conversión de piruvato en acetato. El ácido fórmico es un metabolito común de las bacterias neutrófilas en condiciones anaeróbicas, mientras que B. circulans var. alkalophilus produce hasta 2 g/L del mismo incluso en cultivos aeróbicos. Otros ácidos volátiles como el propiónico, butírico, isobutírico e isovalérico son típicos de las cepas Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus y Bacillus sp. 17-1. Se ha informado de la presencia de ácidos isobutíricos e isovaléricos en los medios de varios bacilos neutrófilos. Pero se considera que estos ácidos, así como los ácidos propiónico y butírico, se originan a partir de aminoácidos basándose en estudios sobre Clostridium sp. . Los ácidos láctico y pirúvico son producidos con bastante frecuencia por bacilos neutrófilos , pero la producción de ácido succínico por Bacillus es rara . No se ha detectado etanol en los bacilos alcalifílicos aunque es un producto típico de los cultivos de glucosa de muchos bacilos neutrófilos . Así pues, las condiciones de crecimiento alcalino pueden afectar a la producción de los metabolitos neutros.

Los estudios iniciales sobre los productos metabólicos en el caso de bacillus sp. se habían llevado a cabo mediante el procedimiento de titrimetría . El aumento de la capacidad amortiguadora del sobrenadante del cultivo bacteriano en torno al pH 5, que es el rango típico de protonación de los ácidos carboxílicos, se utilizó para plantear la hipótesis de que el medio contiene ácidos carboxílicos. En este estudio, hemos utilizado la espectroscopia FT-IR para determinar el grupo funcional de los compuestos presentes en el sobrenadante del cultivo. El espectrógrafo FT-IR mostró los picos característicos del grupo carbonilo (a 1644,98 nm) y del grupo hidroxilo (a 3436,74 nm) (Tabla 1), lo que sugiere la presencia de una especie química formada por el grupo hidroxilo y el grupo carbonilo y es muy probable que se trate de un ácido carboxílico.

Se utilizó el método HPLC de fase inversa para analizar los ácidos orgánicos presentes en el sobrenadante del cultivo. Las condiciones de HPLC se eligieron para obtener la mejor resolución, es decir, pH 2,2 y 1% de acetonitrilo. El método de HPLC de fase inversa es ventajoso por el uso de columnas más económicas, la manipulación más fácil de los parámetros analíticos para optimizar la separación y los análisis a temperatura ambiente . El método se utilizó primero para calcular el tiempo de retención de los estándares de ácidos elegidos según el estudio de la literatura. El orden de elución de los ácidos bajo estas condiciones fue el mismo que el reportado en Tormo e Izco , pero hubo variación en los tiempos de retención observados en este estudio y el reportado en Tormo e Izco . Esta variación puede atribuirse a la diferencia en las condiciones de HPLC, como la temperatura de 25-30°C en este estudio frente a la de 24°C ± 1°C comunicada en Tormo e Izco .

El RP-HPLC del sobrenadante del cultivo muestra la presencia de un único pico con absorbancia a 211 nm que es la longitud de onda de absorción característica de los ácidos orgánicos. Por lo tanto, el sobrenadante contiene una única especie química que probablemente sea un ácido orgánico. La comparación del tiempo de retención de este pico y el tiempo de retención de los ácidos orgánicos estándar muestra que el tiempo de retención es más similar al del ácido fórmico. Esta observación se confirmó además añadiendo ácido fórmico en el sobrenadante del cultivo, lo que aumenta el área del pico del producto (Figuras 2(c) y 2(d)). La presencia de ácido fórmico en el sobrenadante de cultivo concuerda con los productos metabólicos de algunos miembros alcalifílicos del género Bacillus, así como de algunas bacterias alcalifílicas anaerobias sacarolíticas como Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum y Amphibacillus tropicus .

La máxima disminución de unidades de pH que se produce por unidad de tiempo reportada hasta ahora en las bacterias alcalifílicas es de 0,13 unidades por hora en el caso de Bacillus circulans var. alkalophilus que es bastante baja en comparación con la disminución de más de dos unidades durante la 1 h inicial de la inoculación reportada en este estudio. La gran disminución del pH indica una formación de productos de catabolismo ácido. Sin embargo, la tasa de disminución del pH por sí sola no indica el aumento de la concentración de ácidos. Por lo tanto, el análisis cuantitativo del producto metabólico de la bacteria se llevó a cabo mediante RP-HPLC. Se prefirió la HPLC a la GC, ya que una comparación de los métodos de GC y HPLC para la determinación de los ácidos orgánicos en los sobrenadantes de cultivo de las bacterias alcalófilas sugiere que, mientras que la resolución de los ácidos por GLC era excelente, la reproducibilidad cuantitativa por HPLC era mejor que la GLC . Como era de esperar, se comprobó que la concentración de ácido producido aumentaba con el incremento del tiempo de incubación (Figura 4). De hecho, la cantidad de ácido siguió aumentando mucho después de alcanzar el pH mínimo. Esto concuerda con los estudios anteriores sobre la producción de ácido en el caso de Bacillus sp. facultativo y alcalifílico obligado, en los que la producción de ácido siguió aumentando incluso 30 horas después de alcanzar el pH mínimo. El análisis comparativo del producto metabólico producido en medios suplementados con diferentes fuentes de carbono muestra que, aunque el ácido estaba presente en la misma concentración final, la tasa de producción de ácido era más alta en el caso del medio suplementado con sacarosa, seguido de la fructosa y la glucosa (Figura 4). Esto concuerda con las características de crecimiento del organismo en los medios suplementados con estos azúcares.

5. Conclusión

La cepa 12/1 de Exiguobacterium sp. neutraliza el pH del medio externo mediante la producción de ácido orgánico de cadena corta-ácido fórmico. Teniendo en cuenta la aplicación potencial de la biorremediación a gran escala de las aguas residuales alcalinas, esta capacidad de neutralización de álcalis de la bacteria para las aguas residuales de la industria de bebidas puede considerarse como un primer paso hacia la explotación de su potencial de comercialización.

Agradecimientos

N. M. Kulshreshtha agradece a la Comisión de Subvenciones Universitarias por la beca de investigación. Los autores están inmensamente agradecidos al Consejo de Investigación Científica e Industrial, India, por proporcionar una plataforma de R&D e instalaciones para esta investigación.