Las proteínas necesitan interactuar con otras proteínas para formar complejos funcionales. En muchos casos, la función de las proteínas en el interior de las células no puede entenderse sin información sobre la estructura de la proteína y el conocimiento de en qué complejo se encuentra la proteína.1, 2 Esto es, por ejemplo, de suma importancia para las proteínas que modulan la información epigenética en el ADN. Casi todas estas proteínas modificadoras de la cromatina requieren una intensa interacción con enzimas metabólicas, que proporcionan los cofactores necesarios para la acetilación, desacetilación o metilación y desmetilación de las histonas.3-5 Esto pone de manifiesto la necesidad de estudiar el entorno complejo de una determinada proteína para analizar su función y estado de actividad. El entrecruzamiento de proteínas, en combinación con el análisis por espectrometría de masas (XL-MS), es un método ideal para obtener información sobre la estructura de las proteínas y la composición de los complejos proteicos.6-9 Para la XL-MS se necesitan reactivos químicos especializados, los entrecruzadores, que son capaces de conectar covalentemente residuos proteicos que están muy cerca, por ejemplo, interactuando en un complejo.10, 11 La caracterización de los péptidos entrecruzados por medio de la espectrometría de masas, sin embargo, plantea un reto formidable por dos razones. En primer lugar, la identificación de los enlaces cruzados tiene que lograrse analizando los iones de fragmentos no sólo de uno, sino de dos péptidos conectados, lo que complica enormemente los espectros MS2. En segundo lugar, las especies de péptidos reticulados tienen una abundancia muy baja y forman parte de una mezcla de péptidos en la que predominan los péptidos no reticulados. En muchos casos, esto conduce a una dramática pérdida de información que dificulta la identificación precisa del entrecruzamiento y, por tanto, el análisis del interactoma. Se han desarrollado algunos reactivos de entrecruzamiento que han introducido grupos clivables por MS y la posibilidad de enriquecimiento XL para abordar estos problemas.12-18

Aquí, informamos del desarrollo de un nuevo reactivo de entrecruzamiento que es enriquecible y tiene propiedades de clivaje que permiten la identificación precisa de entrecruzamientos. El cliXlink diseñado (1) se representa en la Figura 1. El reactivo permeable a las células (Figura 1 A y Figura S1 en la Información de apoyo) presenta dos unidades de ésteres de succinimidilo que pueden reaccionar con los nucleófilos de las proteínas y están separadas aproximadamente 9 Å, lo que permite fijar distancias cortas para obtener información estructural sobre las proteínas y capturar proteínas muy próximas entre sí. El grupo sulfóxido, bien establecido, garantiza una escisión eficaz de la EM, que puede escindirse en condiciones de disociación inducida por colisión (CID) de baja energía antes de la fragmentación del péptido. Además, una unidad de alquino permite unir una fracción de enriquecimiento, por ejemplo, biotina, a los sitios reticulados con la ayuda de la reacción CuAAC.19

La aplicación del reticulador puede seguir el flujo de trabajo representado en la Figura 1 B. Implica la adición del reactivo 1 a un proteoma complejo, fijando la información de la distancia en estado nativo de los péptidos próximos y preservándolos a lo largo del flujo de trabajo posterior para el análisis por EM. La fijación del grupo de afinidad para el enriquecimiento se realiza después del entrecruzamiento para evitar la interferencia de los grupos de enriquecimiento voluminosos. Mediante la modificación de los péptidos reticulados a nivel proteico, el exceso de reactivos de moléculas pequeñas puede eliminarse fácilmente por precipitación con acetona. A continuación, se procede a la digestión enzimática de las proteínas. Los péptidos reticulados se etiquetan así, por ejemplo, con biotina, lo que permite su enriquecimiento. Posteriormente, se analizan mediante espectrometría de masas. Dado que las masas individuales de los péptidos de un enlace cruzado no son inmediatamente accesibles, la asignación del enlace cruzado es difícil, especialmente en muestras complejas. Esto requiere el uso de reactivos que se puedan escindir por MS, que facilitan la identificación por MS2 mediante la formación de iones de fragmentos específicos.20, 21 En el mejor de los casos, el reactivo también debería permitir los experimentos por MS3, que requiere que el reticulador se escinda antes que los péptidos. Esto permite separar los péptidos para una identificación individual basada en la MS3. Nuestro reactivo 1 contiene átomos de β-hidrógeno a ambos lados del sulfóxido, de modo que la fragmentación se produce en dos direcciones, como se representa en la Figura 1 C. Esto conduce a una separación limpia de los péptidos (α, β) y genera dos fragmentos para cada péptido: un alqueno y un fragmento de ácido sulfénico; este último forma un tial al perder agua. Esto proporciona dos pares de masas con una característica Δm/z≈32. Es importante destacar que observamos que predomina la vía de fragmentación a (Figura 1 C). Por lo tanto, para el péptido α el fragmento alqueno, y para el péptido β el fragmento tial, son los principales productos de escisión. Debido a las propiedades de escisión asimétrica, la mayor parte de la intensidad de la señal se retiene en un fragmento por péptido, lo que debería proporcionar una excelente sensibilidad en los experimentos de MS3.

La síntesis del reactivo 1 es sencilla (esquema 1). El punto de partida es el dímero disulfuro oxidado de la homocisteína 2, que se trata con ácido 4-pentanoico para dar el disulfuro 3. La escisión reductora del disulfuro y la alquilación de los tioles generados con 3-bromopropionato de metilo genera el compuesto sulfurado 4. La saponificación de ambos ésteres metílicos a 5 y la conversión de 5 en el éster de bisuccinimidilo activado 6, seguida de la oxidación del tioéter al sulfóxido, da el reactivo 1 en un rendimiento total del 16 %. Es especialmente importante que el reactivo sea muy puro y que las unidades reactivas del éster estén en su sitio a ambos lados. Hay que evitar la hidrólisis parcial. Esto se aseguró mediante una purificación final por precipitación. El reactivo 1 se disolvió en una mezcla de acetato de etilo y diclorometano y se precipitó al añadir hexanos.

A continuación investigamos las propiedades de EM de 1. Para ello, añadimos 1 a la proteína modelo comúnmente utilizada, la albúmina de suero bovino (BSA). Seguimos el flujo de trabajo representado en la Figura 1 B sin realizar el paso de enriquecimiento. En resumen, tras la adición de 1 a la solución proteica y la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y pH fisiológico, precipitamos la proteína con acetona, la resuspendimos en tampón (véase la Información de apoyo) y digerimos la proteína posteriormente con una mezcla de tripsina y Lys-C.

La mezcla de péptidos obtenida se desaló con columnas C18 Tip y se analizó mediante HPLC-MS2 (Figura 2). La Figura 2 A muestra dos péptidos BSA reticulados (α+β) como ejemplo. Tras determinar la masa exacta del reticulado intacto (m/z 677,1; Figura 2 B), realizamos tanto la fragmentación CID como la HCD en el precursor para evaluar las propiedades de fragmentación (Figura 2 C). La fragmentación CID más selectiva (excitación por resonancia del ion reticulado; Figura 2 C, espectro superior) a una energía de colisión normalizada baja del 25 % proporciona, como se esperaba, sólo un pequeño conjunto de señales intensas. Se obtienen dos pares de señales prominentes, con Δm/z de 32 (Δmrep), debido a la fragmentación del reticulante, que da lugar a un fragmento de tial (α-/β-tal) y de alqueno (α-/β-alqueno) para cada péptido. Como ya se ha mencionado, se prefiere la vía de fragmentación a (Figura 1 C), que da lugar a una distribución de intensidad asimétrica. La formación dominante de los péptidos intactos y separados que se esperan hace que el reactivo sea susceptible de experimentos de MS3 más sofisticados.

Para nuestro estudio, utilizamos la fragmentación HCD. Este método proporciona la escisión simultánea del reticulador y la formación de los fragmentos peptídicos necesarios para la identificación (Figura 2 C, espectro inferior). Para ayudar al reconocimiento del reticulante/péptido, es importante que la fragmentación HCD siga proporcionando los fragmentos de alqueno y tial. Los datos de HCD, por lo tanto, permiten la identificación de péptidos por MS2.

Usando este método, analizamos los datos con el software MeroX disponible gratuitamente, filtrando estrictamente todas las identificaciones de entrecruzamientos (puntuación >50, tasa de falsos descubrimientos (FDR) 1 %) y requiriendo la presencia de al menos tres de cuatro iones de los dos pares de masas característicos.23, 24 Sin explotar la posibilidad de enriquecimiento basado en CuAAC, pudimos identificar 61 entrecruzamientos de BSA únicos en una sola medición (Figura 2 D).25 Este resultado es representativo de las mediciones realizadas con BSA purificada en nuestro laboratorio. Además, representamos los enlaces cruzados encontrados en la estructura cristalina de la BSA y observamos que la mayoría de las distancias medidas eran razonables. Es importante destacar que los enlaces cruzados muestran una distancia media Cα-Cα entre los aminoácidos reticulados de 22,1 Å y una distribución de la distancia que concuerda perfectamente con lo que se espera para el enlace cruzado con un reactivo que espacia los ésteres activos en unos 9 Å (Figuras 2 E y S2)26 y teniendo en cuenta las longitudes de las cadenas laterales y la dinámica molecular de la proteína.27 El entrecruzamiento se produjo principalmente entre dos residuos de Lys (49 %), pero también detectamos conexiones Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) y Lys-Tyr (8 %), de acuerdo con la reactividad de los ésteres de succinimidilo (Figura 2 F).28

Este éxito nos permitió validar el nuevo entrecruzador en un entorno más complejo. En particular, queríamos mostrar el valor adicional de la posibilidad de enriquecimiento basada en CuAAC. Para este experimento, volvimos a reticular la proteína BSA (10 μg), la precipitamos con acetona, volvimos a disolver la proteína reticulada y, posteriormente, realizamos la reacción de clic (Figura S3 A) añadiendo 7 (Figura 3 A) y CuSO4/tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil) amina (THPTA) seguido de la reducción de CuII a CuI al añadir ascorbato sódico. Tras 1 hora a temperatura ambiente, realizamos otra precipitación con acetona para eliminar el exceso de azida de biotina. A continuación, añadimos tripsina y Lys-C para la digestión.

Estos péptidos se combinaron a continuación con un digerido de proteínas obtenido de un extracto de células HEK (435 μg de proteína; Figura 3 B). Esto crea un fondo masivo de péptidos no reticulados. Si ahora analizamos los entrecruzamientos dentro de este gran fondo (Figura 3 C), identificamos sólo un número muy pequeño de coincidencias espectrales de entrecruzamiento (media de CSMs=5,0), sitios únicos de entrecruzamiento (media de XLs únicos=3,7) así como monoenlaces (media=5,3), en los que un éster de succinimidilo se hidroliza antes de reaccionar con la proteína. Sin embargo, si realizamos el enriquecimiento con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, el número de identificaciones de enlaces cruzados mejoró drásticamente. Tras la incubación de la mezcla de péptidos con las partículas magnéticas, el lavado exhaustivo (6×) de las perlas con tampón (véase la información de apoyo) y la escisión reductora suave del disulfuro para liberar los enlaces cruzados «capturados» y, por lo tanto, la eliminación de la fracción de biotina (Figura S3 B), ahora detectamos, por término medio, 95,0 CSM y 37,0 XL únicos junto con 184,3 monoenlaces. El número de XLs únicos identificados fue inferior al de la BSA purificada (Figura 2 D), lo que podría explicarse por ineficiencias en la reacción de CuAAC o por la interferencia del fondo del complejo no reticulado. Sin embargo, este resultado demuestra que nuestro nuevo reticulador, el 1, es capaz de enriquecer los péptidos reticulados en un amplio exceso de péptidos no modificados; facilitando así el análisis de muestras complejas con reticulaciones poco abundantes. Originalmente, éramos escépticos sobre la estructura asimétrica de 1. Los datos, sin embargo, muestran que, a pesar de ello, se identifica un gran número de enlaces cruzados.

En resumen, nuestro nuevo reticulante 1 combina las siguientes ventajas: en primer lugar, el tamaño del reactivo es ideal para obtener valiosa información de distancia para la proteómica estructural. Además, la molécula es permeable a las células y la unidad de alquino no causa una interferencia importante en la reacción de reticulación. Además, la fragmentación robusta y eficiente del sulfóxido simplifica la identificación del entrecruzamiento. La posibilidad de funcionalizar los péptidos reticulados con 1 mediante química de clic permite emplear diversas modificaciones y estrategias de enriquecimiento que permiten el análisis de reticulaciones poco abundantes. Para concluir, nuestro reactivo 1 allana ahora el camino para el análisis de interactomas complejos mediante experimentos de MS2 y MS3.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.