Terapia génica para trastornos no hereditarios

Se han producido muchos avances en la identificación de los mecanismos implicados en el daño orgánico crónico que han abierto vías para los estudios de terapia génica. Mientras que una plétora de estudios preclínicos y clínicos durante las últimas décadas se ha centrado en el desarrollo de la terapia génica para los trastornos hereditarios, a pesar de varios estudios preclínicos en modelos animales, sólo ha habido unos pocos ensayos clínicos que se han llevado a cabo para investigar la eficacia terapéutica de la terapia génica para las enfermedades no hereditarias. Un estudio reciente muestra que la expresión de la telomerasa mediante vectores AAV9 ejerce efectos terapéuticos en un modelo de ratón de fibrosis pulmonar . Esta terapia se dirigió a la fibrosis pulmonar idiopática. Se sabe que los telómeros actúan como estructuras protectoras en los extremos de los cromosomas y se ha demostrado que la presencia de telómeros cortos es una de las causas del desarrollo de enfermedades. En esta enfermedad, los telómeros se vuelven demasiado cortos, lo que provoca el cese de la división celular, que a su vez conduce a la apoptosis de las células. La telomerasa es una enzima que puede reestructurar la longitud de los telómeros, y Povedano y sus colegas desarrollaron un tratamiento utilizando el serotipo 9 de AAV para administrar telomerasa y corregir los telómeros cortos. Como el AAV9 se dirige preferentemente a las células alveolares regenerativas de tipo II (ATII), los ratones tratados con AAV9-Tert muestran una mejor función pulmonar con una reducción de la inflamación y la fibrosis a las 1-3 semanas del tratamiento con el vector. Es interesante señalar que la fibrosis pulmonar mejoró o desapareció a las 8 semanas de la terapia génica. El tratamiento con AAV9-Tert dio lugar a telómeros más largos y a un aumento de la proliferación de las células ATII, así como a una disminución del daño en el ADN, la apoptosis y la senescencia.

La terapia génica cardíaca derivada del vector AAV está surgiendo como una plataforma totalmente nueva para tratar los trastornos cardíacos . La terapia génica con AAV para la insuficiencia cardíaca se ha validado en estudios preclínicos utilizando modelos animales, y la gran mayoría de estos enfoques se han llevado a cabo para mejorar el manejo del calcio por los cardiomiocitos. La proteína terapéutica utilizada en la mayoría de estos estudios fue la ATPasa del calcio sarcoplasmático (SERCA2a). Sobre la base de los resultados preclínicos positivos, se llevó a cabo el primer ensayo clínico (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) para administrar SERCA2a utilizando el vector AAV de serotipo 1 para tratar a pacientes con insuficiencia cardíaca avanzada. El resultado de este ensayo de fase 1 fue exitoso, sin eventos adversos, y pasó al estudio de fase 2a, proporcionando resultados prometedores con una tasa significativamente baja de eventos adversos. Sin embargo, los resultados del ensayo clínico de fase 2b (ensayo CUPID2b, NCT01643330), en el que se utilizó el mismo vector, fueron decepcionantes, ya que no hubo cambios significativos entre el grupo de tratamiento y el de placebo. Esto ha llevado a la interrupción del reclutamiento de pacientes para dos ensayos adicionales utilizando AAV1.SERCA2a . Curiosamente, hay dos nuevos ensayos próximos destinados a administrar S100A1 con un vector AAV9 y una forma constitutivamente activa de los inhibidores de la proteína fosfatasa 1, I1c, con una cápside quimérica con los serotipos AAV2 y AAV8 . Además, los serotipos AAV1, AAV6 y AAV9 han surgido como los más prometedores para la transferencia de genes cardíacos, lo que hace esperar que en el futuro se produzcan enfoques exitosos de terapia génica para tratar la insuficiencia cardíaca.

También se han descrito enfoques de terapia génica mediada por AAV para tratar el dolor neuropático en roedores . Fischer y sus colegas han demostrado que la administración de rAAV que expresa el gen del dominio de unión del canal 3 de Ca2+ (CBD3) redujo significativamente el comportamiento del dolor, como la hiperalgesia tras el contacto con un alfiler o la sensibilidad a la estimulación con acetona en modelos animales de dolor inflamatorio y neuropático . Otro estudio en el que se utilizó un vector AAV9 que codificaba un ARN de horquilla corta (ARNhc) contra el receptor vanilloide 1 (TRPV1), que es un importante gen diana para el dolor agudo, demostró que la terapia atenuaba la alodinia térmica inducida por la lesión nerviosa (aumento de la respuesta de las neuronas) entre 10 y 28 días después del tratamiento en un modelo de ratón de lesión nerviosa preservada (SNI) . Estos resultados proporcionan pruebas positivas para animar a los investigadores de la terapia génica a desarrollar tratamientos basados en vectores AAV para pacientes con dolor neuropático crónico/diabético.

Se han realizado avances considerables en el enfoque de la terapia génica para tratar la fibrosis hepática crónica. Aunque los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) o los bloqueadores de los receptores de angiotensina (BRA) se utilizan ampliamente como tratamientos en pacientes con hipertensión, se han probado en pacientes con enfermedad hepática crónica; sin embargo, los resultados no fueron convincentes, principalmente porque producen efectos secundarios sistémicos adversos . Debido a la falta de tratamientos médicos, el trasplante de hígado se ha convertido inevitablemente en la única opción para los pacientes con enfermedades hepáticas en fase terminal, derivadas de la fibrosis hepática crónica y/o la cirrosis. Además, el aumento de la incidencia de la enfermedad hepática crónica, la falta de órganos de donantes, las complicaciones posteriores al trasplante y el elevado coste del trasplante de hígado hacen que haya una gran necesidad de descubrir y formular nuevas terapias específicas, eficaces, seguras y baratas para la fibrosis/cirrosis hepática.

Una posible aproximación para evitar esto es desarrollar estrategias antifibróticas dirigidas al órgano. Los estudios de nuestro laboratorio sugieren que un posible objetivo es el «eje alternativo» del sistema renina-angiotensina (SRA), que comprende su enzima clave, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ECA2), que descompone el potente octapéptido profibrótico, la angiotensina II (Ang II), en un heptapéptido antifibrótico, la angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)). Los estudios experimentales con animales han demostrado que la ECA2 humana recombinante (rhACE2) es beneficiosa para prevenir la hipertensión en las enfermedades cardiovasculares y para mejorar la función renal en la nefropatía diabética. Curiosamente, la rhACE2 fue bien tolerada por un grupo de voluntarios humanos sanos en un ensayo clínico de fase 1, sin ejercer ningún efecto secundario cardiovascular no deseado . Hay un estudio que informó de los efectos terapéuticos de la ECA2 recombinante en la fibrosis hepática experimental, en la que la lesión hepática fue inducida quirúrgicamente por colestasis o por inyección de tetracloruro de carbono hepatotóxico . Demostraron que la ECA2 recombinante reducía significativamente la fibrosis hepática en ambos modelos animales de enfermedad hepática. Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de este enfoque sistémico es que el tratamiento produce inevitablemente efectos fuera del objetivo, que en muchos casos son indeseables. Así, la administración sistémica de la ECA2 recombinante presenta varios inconvenientes. Esto incluye inyecciones diarias de ACE2, un procedimiento que es invasivo en un entorno clínico y un enfoque costoso con un efecto no deseado en la regulación de la presión arterial . Para evitar este problema, un enfoque ideal sería aumentar los niveles de ECA2 específicos del tejido en el órgano objetivo. Por lo tanto, se espera que el aumento de la actividad de la ECA2 en un órgano específico utilizando un vector AAV recombinante específico para el hígado produzca efectos terapéuticos limitados al órgano objetivo y minimice los efectos no deseados fuera del objetivo.

Además del uso de un serotipo de cápside específico para el hígado, la especificidad puede mejorarse aún más mediante la ingeniería del vector con el gen de la ECA2 bajo el control transcripcional de un fuerte promotor específico para el hígado, la apolipoproteína E/la α1-antitripsina humana. Los estudios publicados por nuestro laboratorio utilizaron un vector AAV específico para el hígado (rAAV2/8) para la evaluación preclínica y descubrieron que la sobreexpresión hepática del gen ACE2 murino administrado a los ratones duraba hasta 6 meses tras una única inyección intraperitoneal . A continuación, tratamos a los ratones con una serie de modelos de enfermedad hepática, que incluían la fibrosis biliar inducida por la ligadura del conducto biliar (BDL), la lesión tóxica inducida por inyecciones de tetracloruro de carbono (CCl4) y la fibrosis hepática asociada al hígado graso inducida por la alimentación con una dieta deficiente en metionina y colina (MCD) utilizando una única inyección intraperitoneal de rAAV2/8-ACE2 . El tratamiento produjo un importante aumento de la expresión y la actividad proteica de ACE2, que se limitó al hígado sin afectar a otros órganos importantes. A diferencia de los trastornos hereditarios, por ejemplo, la hemofilia B, en la que un nivel relativamente bajo de expresión del transgén en el hígado puede ser suficiente para los subsiguientes pequeños aumentos de los niveles de FIX en la sangre , la magnitud de la expresión del transgén necesaria para la intervención terapéutica en la enfermedad no hereditaria puede ser sustancialmente mayor. Esto, a su vez, puede suponer un reto para los investigadores de terapia génica. Sin embargo, en nuestro enfoque terapéutico dirigido al hígado con rAAV2/8-ACE2, encontramos que el aumento de la expresión hepática de ACE2 redujo el nivel hepático de Ang II profibrótica en más de un 50% en comparación con los tratados con un vector de control que llevaba albúmina sérica humana (rAAV2/8-HSA) . La reducción de la Ang II, que se acompañó de un aumento de los niveles hepáticos del péptido antifibrótico Ang-(1-7), dio lugar a una marcada reducción de la expresión de citoquinas inflamatorias, lo que condujo a una profunda reducción de la fibrosis hepática en los tres modelos (Figura 2) . Estos estudios con modelos animales a corto plazo se han validado aún más para proporcionar pruebas de que en modelos animales a largo plazo de fibrosis biliar y enfermedad del hígado graso, que producen lesiones hepáticas más comparables a las que se observan en pacientes con dichas enfermedades, una única inyección intraperitoneal de rAAV2/8-ACE2 causó una profunda reducción de la fibrosis hepática (Figura 3). En marcado contraste con otros estudios en los que se utilizan vectores AAV , descubrimos que el rAAV2/8-ACE2 redujo los niveles de transaminasa de alanina (ALT) en suero en los animales enfermos en comparación con los que recibieron el vector de control (rAAV2/8-HSA), lo que sugiere que el propio vector es seguro en el hígado. Además, el vector rAAV2/8-HSA (hasta 10 días) o rAAV2/8-ACE2 (hasta 24 semanas) inyectado en ratones sanos no produjo ningún cambio en el nivel de ALT en plasma, lo que confirma que es improbable que el vector en sí mismo provoque lesiones hepáticas. La representación esquemática del mecanismo molecular asociado a la terapia génica ACE2 mediante el vector rAAV2/8 en la fibrosis hepática se muestra en la Figura 4.

La administración de genes dirigida al hígado mediante el vector rAAV2/8 ha demostrado ser terapéuticamente prometedora en el hígado adulto, pero sus efectos no se han investigado ampliamente en el hígado inmaduro. Aunque el rAAV2/8 transduce el hígado de ratones neonatos con gran eficacia, el vector no es persistente en el hígado y disminuye rápidamente con el crecimiento del mismo. Por lo tanto, el uso exitoso de la terapia mediada por rAAV2/8 para tratar enfermedades hepáticas en la primera infancia puede requerir la readministración . En línea con esto, otro estudio demostró que el tratamiento de ratones neonatales deficientes en ornitina transcarbamilasa (OTC) con la terapia AAV2/8-OTC no logró proteger a los ratones de la hiperamonemia en la edad adulta . Por lo tanto, producir una transducción estable en el hígado en desarrollo sigue siendo uno de los mayores desafíos para la terapia génica rAAV2/8 específica para el hígado, y la readministración de vectores puede ser necesaria para mantener la eficacia terapéutica en la edad adulta después del tratamiento neonatal temprano.

Aunque los vectores AAV empleados para los estudios preclínicos pueden ser eficaces en el hígado humano, es importante seleccionar un vector AAV específico para los hepatocitos humanos con una mayor eficiencia de transducción . Recientemente, dos grupos han propuesto utilizar ratones humanizados como el modelo de ratón inmunodeprimido FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) para identificar el mejor serotipo de rAAV para la terapia génica dirigida al hígado . Los estudios en el modelo de ratón humanizado repoblado con más del 25% de hepatocitos humanos permitieron a los investigadores identificar vectores AAV específicos para el hígado humano, como el LK-03, derivado de la biblioteca de AAV con ADN de la cápside. Esta biblioteca se generó utilizando 10 genes de cápside de AAV. LK-03, compuesto por cinco cápsides de AAV parentales diferentes, fue capaz de transducir hepatocitos primarios humanos con mayor eficacia in vitro y en un modelo de xenoinjerto de carcinoma hepatocelular in vivo, en comparación con el serotipo 8 de AAV. Wang y sus colegas también informaron de un mayor nivel de transducción hepática en ratones FRG utilizando la cápside de AAVrh10, un AAV del clado E derivado del macaco rhesus, y AAV3B, y han demostrado que los vectores AAV-LK-03 pueden ser superiores a AAV3B o AAV8. Se espera que los investigadores utilicen cada vez más modelos animales humanizados para enfermedades distintas de las hepáticas, lo que les permitirá identificar nuevas variantes de vectores AAV diseñados, la eficacia de la transducción y las reacciones inmunitarias específicas del tejido humano que se está investigando. Además, se ha informado de que el vector AAV3B-eGFP, que fue capaz de causar una expresión robusta de GFP específica del hígado en los hígados de primates no humanos, es significativamente mejor que el AAV8 sin hepatotoxicidad aparente.