γδ-selección

Las células γδT surgen de los timocitos DN, ya que el reordenamiento de las cadenas TCRγ y δ se produce en las etapas DN . Las células precursoras γδ, que tienen el TCRγ y δ reordenados antes de la recombinación del TCRβ, expresan el complejo γδTCR/CD3 en la membrana plasmática, donde el γδTCR se autooligomera, como el pre-TCR, e inicia las vías de señalización intracelular . Esta señal γδTCR induce el proceso denominado «γδ-selección», que confirma la generación de cadenas TCRγδ funcionales, haciendo que la célula reconozca que «soy una célula γδT» .

La señal γδ-selección desencadena la diferenciación de las células precursoras γδ CD5- CD24high a las células γδT CD5+ CD24low . La transición de las células γδT CD5- a las CD5+ está muy deteriorada en los ratones deficientes en Syk, mientras que los ratones deficientes en Zap70 muestran una diferenciación normal de las células γδT CD5+. Los ratones doblemente deficientes en Zap70/Syk muestran una detención completa de la diferenciación de las células γδT en el estadio de precursor CD5-. Por lo tanto, la selección de γδ depende principalmente de la señal mediada por Syk, y Zap70 juega sólo un papel menor y redundante en este proceso. Este mecanismo es bastante análogo al de la selección β. Una diana crítica de Syk en la señal de γδ-selección es el señalosoma Lat, ya que los ratones deficientes en Lat presentan una inhibición completa de la γδ-selección y una falta total de células γδT maduras.

Las células precursoras de γδ procedentes de ratones deficientes en Syk/Zap70 o de ratones deficientes en Lat son indistinguibles de las células del linaje αβT por la expresión de sus proteínas de superficie celular, excepto por el γδTCR, y siguen manteniendo el potencial de diferenciarse en células αβT. ¿Qué determina el destino de la diferenciación hacia el linaje αβT o γδT a partir del precursor? Esta pregunta ha sido abordada por estudios que utilizan ratones transgénicos γδTCR. Cuando la señal γδTCR se debilita por una deficiencia de proteínas señalizadoras o de ligandos endógenos para el γδTCR transgénico, las células precursoras dieron lugar a células DP del linaje αβT a expensas de las células del linaje γδT . Estos resultados sugieren que una señal más fuerte (probablemente al interactuar el γδTCR con el ligando) conduce al compromiso con las células γδT, mientras que una señal más débil (probablemente por el pre-TCR independiente del ligando) conduce a la diferenciación αβT. Sin embargo, los experimentos realizados con otra cepa de ratones transgénicos que expresan γδTCR con la misma especificidad de ligando demostraron que las células γδT eran capaces de madurar en ausencia de los ligandos . Chien y sus colaboradores emplearon un método de tinción tetramérica para identificar la población de células γδT específicas del ligando con el fin de examinar la importancia de los ligandos endógenos del γδTCR en ratones no transgénicos. Los resultados mostraron claramente que el número de células γδT específicas de ligando era comparable entre los ratones deficientes en ligando y los ratones con ligando, lo que sugiere que la mayoría de las células γδT no han encontrado ligandos durante la diferenciación tímica. Los autores también aportaron pruebas de que algunos γδTCRs pueden señalar de forma independiente del ligando . Estas observaciones contradicen evidentemente el modelo anterior de que el compromiso del linaje γδT requiere la interacción del ligando γδTCR. Dado que las células γδT policlonales reactivas a ciertos ligandos exógenos se diferencian y maduran funcionalmente en el timo, es probable que las observaciones en ciertas líneas de ratones transgénicos γδTCR no reflejen la mayoría de las células γδT con γδTCR policlonales.

Para examinar el impacto de la señal de selección γδ en la diferenciación αβT/γδT, utilizamos ratones deficientes en Lat, en los que la diferenciación de las células γδT se detiene en el estadio de precursor CD5-. Se purificaron células precursoras γδTCR+ de ratones adultos deficientes en Lat, se infectaron con retrovirus que expresaban Lat y se cultivaron en monocapas de células estromales (Fig. 2a). Este experimento permite la evaluación directa del fenotipo celular antes y después de la selección de γδ bajo una condición libre de ligando. En comparación con las células de control no transducidas, las células γδT que expresan Lat mostraron una marcada inducción de la expresión superficial de CD5 (Fig. 2b), así como la expresión de ARNm de los genes característicos de las células γδT (Tcrd, Egr3, Runx3 y Bcl-2), y la abrogación completa de la transcripción de los genes asociados con las células DN precursoras y las células αβT (Rag1, Rag2 y Ptcra) (Fig. 2c). Estos resultados indican que la señal γδTCR impulsa la diferenciación hacia el linaje γδT y reprime la diferenciación hacia el linaje αβT de forma independiente del ligando.

En conjunto, aunque los mecanismos son todavía esquivos (y debatidos) por los que el pre-TCR y el γδTCR dirigen los procesos de diferenciación hacia los linajes αβT y γδT, respectivamente, es probable que la γδ-selección, al menos en la mayoría de las células γδT generadas de forma natural, no dependa de un ligando γδTCR afín en el timo.

La fuerza de la señal γδTCR determina la diferenciación γδT17/γδT1

Durante el desarrollo de los linajes αβT y γδT, la expresión de Syk y Zap70 está regulada de forma inversa: Syk se expresa altamente en las etapas tempranas (DN1-3 y precursor γδ) y se regula a la baja a partir de entonces, mientras que Zap70 se expresa en las etapas más tardías (después de la selección β o γδ) . Las células γδT que han pasado por la selección γδ expresan altos niveles de Zap70 así como de complejos γδTCR/CD3 y pueden responder a ligandos endógenos si se proporcionan en el timo. Actualmente se reconoce que, a diferencia de las células αβT, las células γδT no se someten a una selección positiva impulsada por ligandos ni a una eliminación clonal en el timo. Varios estudios han sugerido que la interacción del ligando γδTCR en el timo controla en cambio la función efectora de las células γδT.

Utilizando la tinción tetramérica de una población de células γδT que es reactiva a las moléculas no clásicas del MHC de clase I T10 y T22, el grupo de Chien descubrió que las células γδT sin antígeno que se desarrollaban en ausencia de los ligandos producían preferentemente IL-17, mientras que las células γδT experimentadas con antígeno que se desarrollaban en presencia de los ligandos producían predominantemente IFNγ . Este estudio sugirió por primera vez la idea de que una señal γδTCR fuerte inducida por un ligando y una señal γδTCR débil inducen células γδT1 y γδT17, respectivamente. Un estudio reciente con ratones deficientes en T10/T22 recientemente generados informó esencialmente de los mismos resultados, apoyando este «modelo de fuerza de la señal» . Este modelo ha sido respaldado por otros estudios. La maduración tímica y la diferenciación efectoras de las células Vγ5Vδ1 γδT requieren Skint1 (y probablemente otras proteínas de la familia Skint), una putativa proteína coestimuladora del TCR Vγ5Vδ1 . En ausencia de Skint1, las células Vγ5Vδ1 γδT se desvían hacia un fenotipo de célula γδΤ17 a expensas del fenotipo de célula γδΤ1 . Además, el desarrollo de las células γδT1 también requiere la coestimulación a través de CD27, una proteína de la superfamilia de receptores del TNF que se expresa en las células γδT1, pero no en las γδT17 . Más recientemente, el grupo de Pennington identificó células γδT bipotentes (CD24lo CD44lo CD45RBlo) que pueden dar lugar tanto a células γδT17 como a células γδT1. En el cultivo de órganos del timo fetal, el desarrollo de las células γδT17 fue inhibido por fuertes señales de TCR inducidas por la estimulación con anticuerpos anti-TCRδ o anti-CD3ε, pero estos efectos fueron abrogados por la inhibición farmacológica de la vía MEK/ERK . Estos datos proporcionan pruebas directas en apoyo de la idea de que la fuerza de la señal γδTCR es un determinante crítico de la función efectora de las células γδT.

A nivel transcripcional, la fuerte señal γδTCR induce la expresión de reguladores transcripcionales asociados a γδT1, como Egr2, Egr3 e Id3, lo que resulta en un destino celular γδT1 . Id3 inhibe la adopción del destino celular γδT17 al inhibir la regulación transcripcional mediada por HEB (codificada por Tcf12) . HEB puede unirse directamente a los sitios de inicio transcripcional de Sox4 y Sox13 para promover su expresión. Estos factores transcripcionales asociados a γδT17 son necesarios para la expresión del factor transcripcional esencial RORγt (codificado por Rorc) y la proteína de señalización Blk . Teniendo en cuenta estos hechos, el modelo de fuerza de la señal del TCR demuestra claramente los mecanismos por los que la señal del TCR controla la función efectora de las células γδT.

Sin embargo, una serie de estudios ha demostrado el impacto de la ablación genética de las moléculas de señalización del TCR en la función efectora de las células γδT, desafiando la idea de que la fuerza de la señal del γδTCR determina por sí sola el destino de diferenciación γδT17/γδT1. Los ratones mutantes Zap70 W163C presentan una pérdida completa del desarrollo de las células Vγ6+ γδT17 pero tienen un desarrollo normal de las células γδT1, mientras que las señales TCR están amortiguadas en estos ratones . Otro estudio realizado por Silva-Santos y colaboradores demostró que los ratones haploinsuficientes para CD3δ y CD3γ (CD3DH), que tenían una menor expresión en la superficie celular de los complejos γδTCR/CD3 y una señalización γδTCR alterada mostraron una marcada reducción del desarrollo tímico de las células Vγ6+ γδT17, así como de las células γδT1, pero no de las células Vγ4+ γδT17, lo que indica que los subconjuntos γδT17 requieren una fuerza de señalización γδTCR distinta para su desarrollo . Aunque el desarrollo de las células αβT y la transducción de la señal αβTCR no se vieron afectados en los ratones CD3DH, esta cepa de ratón es el único modelo animal hasta ahora en el que se ha demostrado la inhibición específica de la señalización γδTCR. Sigue sin estar claro por qué las células γδT están afectadas específicamente en los ratones CD3DH, pero es probable que la composición distinta de los complejos TCR-CD3 αβT y γδT explique el fenotipo único de los ratones CD3DH. En este contexto, cabe señalar que los ratones con la mutación CD3ε C80G, que es incapaz de inducir cambios conformacionales en el TCR, también presentan una alteración en el desarrollo de las células γδT17, pero un desarrollo normal de las células γδT1.

Syk es necesaria para la diferenciación de las γδT17

Recientemente, informamos de un nuevo mecanismo de regulación por el cual las quinasas proximales del γδTCR, Syk y Zap70, controlan diferencialmente la inducción de las γδT17 . Los ratones deficientes en Syk presentan una pérdida completa de células γδT17 (tanto los subconjuntos Vγ4+ como Vγ6+) en el timo. En particular, la expresión forzada de Zap70 en las células progenitoras T deficientes en Syk no logró restaurar la generación de células γδT17, lo que sugiere un papel no redundante de Syk en la diferenciación γδT17. Como las células γδT deficientes en Syk, pero no en Zap70, muestran una reducción significativa de la fosforilación de Akt inducida por la estimulación de γδTCR, se indica que esa Syk media la activación de la vía PI3K-Akt inducida por γδTCR. Los ratones deficientes en PI3K (p110γ-/- p110δ-/-) presentan una inhibición completa del desarrollo de células γδT17, pero no se ven afectados en cuanto a la selección de γδ (regulación al alza de CD5) o al desarrollo de γδT1. La inhibición de PI3K ha demostrado reducir la expresión de los factores de transcripción asociados a γδT17 (Rorc, Sox13 y Sox4), lo que sugiere un papel crucial de la vía PI3K-Akt en la inducción del programa de diferenciación de γδT17. De acuerdo con esto, un informe anterior demostró que los ratones con PI3Kδ inactiva o con deficiencia de PI3Kγ presentan una marcada reducción del número de células γδT17 periféricas y una mejora de la inflamación dependiente de γδT17. La vía PI3K-Akt también es necesaria para la diferenciación de las células αβT (Th17) productoras de IL-17 , lo que sugiere que esta vía de señalización es un mecanismo regulador común compartido por los linajes αβT y γδT para inducir subconjuntos proinflamatorios productores de IL-17.

La activación de la vía PI3K-Akt inducida por el γδTCR depende de Syk pero no de Lat, lo que indica que Syk impulsa la vía PI3K-Akt para inducir la diferenciación γδT17 además de la vía de señalización principal dependiente de Lat que induce la selección γδ . No está claro si Syk activa la vía PI3K/Akt en las células γδT a través de una interacción directa o de forma indirecta. Un estudio anterior informó de que los ratones deficientes en Rasgrp1 muestran un fenotipo efector de células γδT similar al de los ratones deficientes en PI3K (es decir, una pérdida de células γδT17 y un aumento de células γδT1) . Dado que Rasgrp1 puede funcionar como un activador ascendente de la vía PI3K/Akt en la señalización αβTCR , es probable que Rasgrp1 retransmita las señales de γδTCR a PI3K para inducir la diferenciación de γδT17.

La pérdida preferencial de células γδT17 también se ha observado en ratones deficientes para Blk, una quinasa de la familia Src que se expresa tanto en las células γδT como en las células B, aunque se desconoce su función en la transducción de señales γδTCR.

Zap70 controla ciertos subconjuntos de células γδT

También hemos demostrado el papel de Zap70 en la diferenciación tímica de las células γδT . Los ratones deficientes en Zap70 muestran una marcada reducción de las células Vγ6+, la mayoría de las cuales son γδT17, pero no están afectados en cuanto al desarrollo de otras células γδT, incluyendo los subconjuntos Vγ1+ así como Vγ4+. De hecho, el nivel de expresión de la proteína Zap70 fue mayor en el subconjunto Vγ6+ entre las células γδT. Como la expresión de CD5 era menor en las células Vγ6+ deficientes en Zap70 que en las células de control, es probable que Zap70 sea necesario para la maduración tímica de las células Vγ6+. En nuestros experimentos, los ratones deficientes en Zap70 tuvieron una diferenciación tímica normal de las células Vγ4+, incluido el subconjunto γδT17, lo que contradice el informe anterior en el que una mutación hipomórfica de Zap70 causó una reducción de las células Vγ4+ γδT17 tímicas. Esta discrepancia puede deberse a los diferentes ratones utilizados en los dos estudios (el grupo de Hayday utilizó ratones mutantes Zap70 hipomórficos en un fondo BALB/c, mientras que nosotros utilizamos ratones completos deficientes en Zap70 en un fondo C57BL/6). Además, los ratones deficientes en Zap70 mostraban una reducción significativa de las células Vγ4+ periféricas, que incluían los subconjuntos γδT17 y γδT1, pero tenían células Vγ1+ no deterioradas. Así, en contraste con su papel esencial en el desarrollo de las células αβT, el requerimiento de Zap70 se limita a la maduración tímica de las células Vγ6+ y al mantenimiento periférico de las células Vγ4+.

Nuestros hallazgos sobre las diferentes funciones de Zap70 y Syk podrían proporcionar una nueva pista para entender los mecanismos de señalización de γδTCR y el desarrollo de las células γδT. Zap70 es necesario para la señalización de αβTCR y γδTCR en ciertos subconjuntos de células γδT. En las células αβT, la activación de Zap70 depende de Lck, que se acopla a los coreceptores CD4 o CD8 que se unen al pMHC en la superficie de las células presentadoras de antígenos . Así, se sugiere que Lck-Zap70 es un eje de señalización especializado en el reconocimiento de antígenos logrado por el contacto célula-célula; aunque en el caso de las células γδT, sigue sin estar claro cómo se activa Zap70 a pesar de la falta de expresión de CD4 y CD8. Por el contrario, Syk se asocia a una amplia gama de inmunorreceptores, como el pre-TCR, el γδTCR, el BCR y el FcR . Dado que Syk es capaz de fosforilar los ITAM y las dianas descendentes independientemente de las quinasas de la familia Src, como Lck, estos receptores pueden activarse independientemente del ligando o al unirse a una variedad de antígenos solubles y de la superficie celular. Así, la utilización de Syk o Zap70 en la señalización de los inmunorreceptores puede dictar la forma en que el receptor reconoce el antígeno. De hecho, la expresión de Syk en lugar de Zap70 hizo que las células αβT fueran capaces de responder a la estimulación de anticuerpos anti-CD3 solubles, mientras que las células αβT normales sólo respondieron a anticuerpos anti-CD3 multimerizados que imitan la interacción con el pMHC de la superficie celular. Estos hallazgos nos llevaron a plantear la hipótesis de que el modo de reconocimiento del antígeno utilizado por los linfocitos podría estar determinado no sólo por su receptor per se, sino también por el uso distinto de las quinasas de la familia Syk. Basándonos en este concepto, predecimos que existen ligandos γδTCR endógenos de superficie celular necesarios para la maduración tímica de las células Vγ6+, así como para el mantenimiento periférico de las células Vγ4+, y que las células Vγ1+ no requieren ligandos γδTCR de superficie celular para su desarrollo y/o mantenimiento.

Procesos independientes y dependientes de γδTCR para la inducción de γδT17

Un informe reciente demostró elegantemente que las células γδT17 surgen de un progenitor que es distinto de los otros subconjuntos de células γδT . Se informó de que se identificaron progenitores intratímicos de origen fetal que expresaban altos niveles de Sox13 en una población previamente categorizada como timocitos DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi). Estos progenitores Sox13+ dieron lugar preferentemente a células γδT17 en el timo fetal reconstituido, mientras que otros progenitores de la población DN2 no lo hicieron. Y lo que es más importante, los progenitores Sox13+ eran detectables y sus programas de linaje γδT17 estaban intactos en los ratones con deficiencia de TCRδ o de Rag, lo que indica que el destino del linaje γδT17 está «preconfigurado» por un mecanismo intrínseco a la célula e independiente de γδTCR. Sin embargo, un informe anterior demostró que las células γδT17 pueden desarrollarse a partir del estadio DN2 (CD44+CD25+c-kithi) cuando se co-cultivan en una monocapa de células estromales que expresan el ligando Notch. Por lo tanto, puede ser necesario redefinir las etapas de diferenciación y las relaciones progenitoras-descendientes en el desarrollo de las células γδT.

La figura 3 resume los procesos de diferenciación de las células γδT así como de las células αβT, destacando las diferencias en el requerimiento de señales αβ/γδTCR y de quinasas de la familia Syk. Los primeros pasos de la diferenciación, es decir, la selección β para el linaje de células αβT y la selección γδ para el linaje de células γδT, son impulsados por la señalización pre-TCR o γδTCR independiente de ligando, que sirve como punto de control para las células que expresan una cadena TCRβ funcional o una cadena γδTCR, respectivamente. Estas señales receptoras independientes de ligando son iniciadas por Syk, que se expresa en los timocitos DN, incluidos los precursores γδT. En el linaje de células γδT, la señal γδTCR mediada por Syk también es necesaria para el cebado de la diferenciación de las células γδT17 a través de la activación de la vía PI3K. Durante la selección β y la selección γδ, la expresión de Syk y Zap70 está regulada de forma inversa: Syk se regula a la baja mientras que Zap70 se regula al alza tras la señalización pre-TCR o γδTCR. Por lo tanto, el último paso en la diferenciación del linaje αβT depende de la señalización αβTCR mediada por Zap70, que permite a los timocitos DP reconocer el pMHC en la superficie de los TEC para ser seleccionados positiva o negativamente según la fuerza de la interacción αβTCR-pMHC. Por el contrario, la señalización γδTCR mediada por Zap70 en respuesta a ligandos endógenos determina la función efectora de las células γδT: una señal fuerte induce γδT1, mientras que una señal débil/no induce γδT17.

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