Generación de ratones knockout

Las tecnologías utilizadas para generar ratones knockout incluyen la recombinación homóloga (o gene targeting) y la captura de genes. Ambos enfoques implican el uso de células madre embrionarias (ES) de ratón que se aíslan de embriones de ratón a los cuatro días de la fecundación. En el primer enfoque, la recombinación homóloga, se introduce en el núcleo de una célula madre embrionaria de ratón un ADN artificial con secuencias de flanqueo homólogas (idénticas) a las que se encuentran aguas arriba y aguas abajo de la secuencia de ADN del gen objetivo. La célula ES reconoce las secuencias de flanqueo homólogas e intercambia el ADN del gen diana existente por segmentos del ADN extraño. El ADN extraño, sin embargo, es inactivo. Por lo tanto, su incorporación al genoma de la célula ES inactiva, o elimina, el gen diana. El ADN extraño suele estar diseñado para llevar un gen informador, que marca o etiqueta la ubicación del gen existente, lo que permite a los investigadores rastrear su presencia en el genoma de la célula de ratón a medida que las células se replican. La recombinación homóloga es el método elegido cuando se requiere que un alelo (gen) específico sea sustituido por una secuencia de ADN manipulada sin afectar a otros genes del genoma.

La captura de genes también hace uso de ADN artificial que lleva un gen informador. Sin embargo, en lugar de dirigirse a un gen específico, el ADN extraño se incorpora al azar a cualquier gen del genoma de la célula ES de ratón. La secuencia extraña impide que el gen alterado codifique sus productos proteicos, con lo que el gen queda inactivo. La activación del gen informador tras su incorporación al genoma de la célula ES permite a los investigadores realizar un seguimiento de la actividad del gen y deducir la función del gen alterado.

Las secuencias artificiales de ADN suelen introducirse en las células ES de ratón mediante un retrovirus u otro vector viral, y las células ES modificadas se cultivan a continuación. Al cabo de unos días, las células se inyectan en embriones tempranos de ratón, que posteriormente se implantan en el útero de una hembra sustituta, donde finalmente se desarrollan y llegan a término. Las crías de ratón nacidas de este modo contienen tanto tejido modificado como no modificado y, por tanto, no son ratones knockout completos. Para generar una pareja de verdaderos ratones knockout (knockouts homólogos), los ratones deben ser criados durante varias generaciones. Inicialmente, los animales se cruzan con otros ratones para producir individuos heterocigotos (ratones con una copia del gen objetivo); los animales heterocigotos se cruzan luego para producir homocigotos.