MÉTODOS DE ENSAYO PARA LA FOTOTOXICIDAD Y ALTERNATIVOS EN ANIMALES

Es esencial garantizar la fotoseguridad de las sustancias químicas cuando hay posibilidades de exposición humana, como puede ejemplificarse claramente con los productos farmacéuticos (20) o los cosméticos (21). Para evaluar el potencial de fototoxicidad de una sustancia química, se han introducido varios métodos de ensayo que van desde los ensayos in silico(22), in chemico(23), in vitro a in vivo. Se han desarrollado y utilizado de forma rutinaria ensayos in químico como la generación de ROS (24), ensayos in vitro que incluyen el ensayo de NRU 3T3 y el modelo de epidermis en 3D, y estudios in vivo que emplean cobayas, ratones o ratas pigmentadas (25).

Fuente de luz para la fototoxicidad. La fuente de luz para la fototoxicidad es extremadamente importante, ya que las longitudes de onda absorbidas por la sustancia química de ensayo (espectro de absorción) y la dosis de luz (alcanzable en un tiempo de exposición razonable) deben ser suficientes para inducir la fototoxicidad (26). Los simuladores solares que simulan la luz solar natural se consideran la fuente de luz artificial ideal (Fig. 5).

La distribución de la potencia de irradiación del simulador solar filtrado debe aproximarse a la de la luz diurna exterior. Los simuladores solares están equipados con arcos de xenón o arcos (dopados) de mercurio y haluro metálico. También deben estar convenientemente filtrados para atenuar las longitudes de onda UVB altamente citotóxicas. El espectro registrado por debajo de estos filtros no debe desviarse de la luz diurna normalizada en exteriores (Especificación: FDA CFR Parte 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

No obstante, también pueden utilizarse otras fuentes de luz UVA, como la lámpara UVA, con un dosímetro UV adecuado para comprobar la intensidad y la longitud de onda. La intensidad de la luz (irradiancia) varía en función de las fuentes, y debe comprobarse regularmente antes de cada ensayo de fototoxicidad utilizando un medidor de UV de banda ancha adecuado. El UV-metro debe haber sido calibrado antes de cada medición. En consecuencia, el tiempo de irradiación depende de la intensidad de la fuente de luz (por ejemplo, para una fuente de luz de 1,7 mW/cm2, es necesario un tiempo de exposición de 50 minutos para alcanzar 5 J/cm2). El tiempo de irradiación también varía en función de los métodos de ensayo. Se determinó que una dosis de 5 J/cm2 (medida en el rango UVA) no era citotóxica, pero sí lo suficientemente potente como para excitar a las sustancias químicas y provocar reacciones fototóxicas en el ensayo de captación de rojo neutro de 3T3.

Ensayo de captación de rojo neutro 3T3. El ensayo de captación de rojo neutro 3T3 ha sido aprobado oficialmente por la OCDE y refrendado como OECD TG432 el 13 de abril de 2004 (3). Este ensayo evalúa la fotocitotoxicidad determinando la reducción relativa de la viabilidad celular tras la exposición al artículo de ensayo en presencia frente a la ausencia de irradiación UV/VIS. La decisión de llevar a cabo el ensayo de fototoxicidad de la NRU 3T3 se refiere a los productos químicos que muestran espectros de absorción en la región UV/VIS cuando se disuelven en el disolvente adecuado (17). Se ha sugerido que si el coeficiente de extinción/absorción molar es inferior a 10 litros x mol-1 x cm-1 es poco probable que la sustancia química sea fotorreactiva (por ejemplo, en una cubeta UV con un trayecto de luz de 1 cm de longitud, la DO de una solución 0,05 M debe ser inferior a 0,5 para que se considere no fotorreactiva según la ecuación «absorbancia = coeficiente de extinción x longitud del trayecto x concentración») (26). La prueba 3T3 NRU presenta una capacidad de predicción muy sensible pero poco específica (una sensibilidad del 93% y una especificidad del 84%). La prueba NRU 3T3 tiene muchas limitaciones. No puede predecir efectos adversos distintos de la foto(cito)toxicidad que pueden surgir de la acción combinada de una sustancia química y la luz, como la fotogenotoxicidad, la fotoalergia(fotosensibilización) o la fotocarcinogenicidad. El ensayo NRU 3T3 sólo se emplea para la identificación de peligros, mientras que su utilidad para la evaluación de la potencia fototóxica no está garantizada. En particular, este sistema de ensayo carece de actividad metabólica, que es fundamental en la manifestación de sustancias químicas expuestas sistémicamente. Por lo tanto, en el caso de las sustancias químicas expuestas sistémicamente que requieren una activación metabólica, como la monocrotalina, la riddelliina y la heliotrina (alcaloides de pirrolizidina) (28), se recomiendan los estudios in vivo en animales (5,29).

El principio de ensayo fundamental de la NRU 3T3 es la comparación de la viabilidad celular en presencia o ausencia de irradiación UV/Vis, determinada con el colorante vital, rojo neutro, que es un colorante catiónico débil que penetra fácilmente en las membranas celulares y se acumula intracelularmente en los lisosomas de las células viables. La línea celular base es la célula Balb/c 3T3, que es un fibroblasto de ratón desarrollado a partir de embriones de ratón por G.T. Todaro en 1968. La designación 3T3 significa «transferencia de 3 días, inóculo de 3 × 105 células» en un plato de 20 cm2, y esta célula es relativamente estable, fácilmente disponible y fácil de manejar (30). El fibroblasto dérmico es una de las células diana de la fototoxicidad, lo que proporciona una sólida justificación para el empleo de células 3T3.

Para decidir si el artículo de ensayo es fototóxico o no en el ensayo 3T3 NRU, se obtendrá la concentración-respuesta en presencia y en ausencia de irradiación. Se calculará el factor de fotoirritación (PIF) o el efecto fotográfico medio (MPE) (31). El PIF es la relación entre el IC50 (concentración que disminuye la viabilidad de las células en un 50%) de las no irradiadas con respecto a las irradiadas, como se muestra en la Fig. 7.

Modelo de predicción de la fotocitotoxicidad por PIF (factor de fotoirritación).

Cuando no se puede obtener el IC50, el MPE se calcula como la siguiente ecuación

PIF < 2 o un MPE < 0,1 predice: «sin fototoxicidad». Un PIF > 2 y < 5 o un MPE > 0,1 y < 0,15 predice: «probable fototoxicidad» y un FPI > 5 o un MPE > 0,15 predice: «fototoxicidad» (Fig. 8).

Cálculo del fotoefecto: El fotoefecto (PEC) a una concentración arbitraria C se define como el producto del efecto respuesta (REC) y el efecto dosis (DEC), es decir, PEC = REC × DEC. La definición se ilustra a partir de (31). El cálculo del fotoefecto a la concentración 0,4 sigue las ecuaciones indicadas en el texto y da: efecto respuesta RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, efecto dosis DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43, y fotoefecto PE0,4 = 0,24. El fotoefecto medio se obtiene promediando los valores del fotoefecto a distintas concentraciones (31).

Prueba de hemólisis de eritrocitos. Las membranas celulares son vulnerables a los ROS y radicales generados fotoquímicamente. Los daños inducidos por los rayos UVA en los eritrocitos y la hemólisis resultante (fotohemólisis) se utilizan para evaluar el potencial fototóxico de los artículos de prueba (32). Los glóbulos rojos de oveja (SRBC) se incuban con productos químicos y se irradian con UVA a 20 J/cm2. Tras la irradiación, los glóbulos rojos de oveja se incubaron en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente y luego durante 1 hora más a 37℃, tras lo cual se midió la hemólisis con el reactivo de Drabkin y la medición de la absorbancia UV a 540 nm. El grado de fototoxicidad se evaluó por la liberación de hemoglobina de los glóbulos rojos, es decir, la actividad fotohemolítica, según la ecuación (33).

• ADE: densidad óptica de la solución de droga expuesta con eritrocitos

• AD: densidad óptica de la solución de droga expuesta sin eritrocitos

• C: densidad óptica de la solución de control 100% hemolítica

Los fototóxicos como la ciprofloxacina, la norfloxacina o la enoxacina aumentan significativamente la actividad fotohemolítica más allá del 20% a 100 μg/mL. La sensibilidad, la especificidad y la precisión de esta prueba fueron del 67%, el 73% y el 73%, respectivamente, para 24 sustancias químicas (8 fragancias, 5 absorbentes de UV, 4 fármacos, 4 antimicrobianos y 3 colorantes) en comparación con la prueba in vivo en cobayas (34). La baja sensibilidad puede ser problemática y su rendimiento es muy inferior al de la prueba NRU de 3T3, lo que puede explicar la disminución del uso de esta prueba en los últimos tiempos.

Modelo in vitro de epidermis humana en 3D. Para superar las limitaciones de los métodos basados en células in vitro, se está investigando el modelo de epidermis reconstruida en 3D para su aplicación a los ensayos de fototoxicidad (35,36). Básicamente, el principio de la prueba es similar al de la prueba NRU de 3T3, es decir, la evaluación de la diferencia de viabilidad del tejido entre la presencia y la ausencia de irradiación UV/VIS. Se puede utilizar un modelo de predicción similar empleando FPI y MPE (37). En el modelo de epidermis en 3D, sin embargo, se pueden ensayar materiales insolubles en agua y se conserva un cierto grado de capacidad metabólica en los queratinocitos primarios de la capa epidérmica que puede aplicarse a los tóxicos que requieren activación metabólica (38). Además, la medición de la producción de citoquinas como la IL-1β (Interleucina-1β) (39), el ensayo cometa (40) y el examen histológico son posibles que pueden considerarse en la evaluación posterior de la fotoalergenicidad y la fotocarcinogenecidad.

Métodos in vivo que emplean cobayas, ratones o ratas pigmentadas. Los animales de laboratorio, como los ratones y las cobayas, se emplean para simular el escenario real de la fototoxicidad humana. Los animales se exponen a sustancias químicas por vía tópica o sistémica y se irradian con una dosis adecuada de rayos UVA (generalmente 10 J/cm2 para el ensayo con cobayas, 20 J/cm2 para el ensayo con ratones (41)). La puntuación del eritema y el edema de 0 a 4 se suma y la puntuación máxima durante 72 horas de observación se promedia por animal para generar el índice de irritación. El índice de fototoxicidad se obtiene mediante la ecuación «Índice de irritación de la zona irradiada con rayos UVA – Índice de irritación de la zona no irradiada» (42). El índice de fototoxicidad superior a 0,6 indica el potencial de fototoxicidad. Alternativamente, se puede medir el grosor de la oreja para estimar el edema en los ensayos con ratones. Estas pruebas in vivo reflejan bien el proceso fisiopatológico de la fototoxicidad en el ser humano, pero los sacrificios de animales, los gastos y el tiempo necesarios para llevar a cabo la prueba plantean muchos problemas, especialmente en la era de la concienciación generalizada sobre el bienestar animal y la ética. Las pruebas de fototoxicidad no basadas en animales están ganando popularidad en estos días para superar estos problemas (43).

Métodos in-químicos para la evaluación de la fototoxicidad. Se han explorado métodos de probeta sin células, es decir, in chemico, para evaluar la fototoxicidad. Se ha analizado la información sobre la absorbencia de la luz y la fotoestabilidad del artículo de prueba para predecir la fototoxicidad (44). Utilizando la generación de especies reactivas de oxígeno durante la fotoexcitación y la posterior fotorreacción, se puede evaluar el potencial fototóxico de una sustancia química in chemico(12). El oxígeno singlete se detecta mediante el blanqueo con p-nitrosodimetilanilina (RNO), mientras que la prueba de Nitro Azul-Tetrazolio (reacción de NBT-formazán) se emplea para determinar la generación de peróxido, como se muestra a continuación (24),

• Oxígeno de los solitarios + imidazol

• → imidazol oxidado

• + RNO

• → blanqueo con RNO + productos

El ensayo de generación de peróxido mostró una sensibilidad y especificidad del 90% y el 769% para los cosméticos y del 100% y 75% para los productos químicos no cosméticos. La actividad de rotura de la cadena de ADN es otra forma de evaluar la fototoxicidad inducida por la radiación UV de diferentes tipos de sustancias químicas o fármacos en química mediante la cuantificación del ADN circular abierto o cerrado. Este ensayo tampoco requiere células o tejidos vivos, sino plásmidos. El plásmido se disuelve en un tampón y se mezcla con los artículos de prueba. Tras irradiar la mezcla con UV, las muestras se someten a electroforesis. La cantidad de ADN roto se analiza mediante tecnología basada en la fluorescencia. Los resultados de los compuestos fototóxicos inducidos por la UV abren las hebras de ADN y dependen de la concentración del fármaco y de la dosis de irradiación UV (33). Estas pruebas no requieren células vivas ni tejidos que puedan aumentar la variabilidad de los resultados de las pruebas. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones que incluyen la falta de capacidad de activación metabólica, la inaplicabilidad de materiales insolubles en agua (aceites, sólidos, geles, productos formulados) y la incapacidad de predecir la fotogenotoxicidad, la fotoalergia (fotosensibilización) o la fotocarcinogenicidad. Este ensayo se limita a la identificación del peligro, no a la evaluación de la potencia fototóxica.