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Usando NEBcutter
NEBcutter acepta una secuencia de entrada, que puede ser pegada, recogida de un archivo local o recuperada del NCBI como un archivo GenBank a través de su número de acceso. Hay varias opciones disponibles para seleccionar el tamaño de los ORF que se van a mostrar y el conjunto de enzimas de restricción que se van a utilizar. El programa calcula las posiciones de todos los sitios de enzimas de restricción, señalando aquellos que podrían ser potencialmente bloqueados por el solapamiento de la metilación, y encuentra los ORF en la secuencia. A continuación, muestra un diagrama esquemático de la secuencia, los ORF largos, basándose en las reglas descritas en los Métodos y todas las enzimas de restricción que la cortan una sola vez. La pantalla inicial también muestra las enzimas que se pueden utilizar en una digestión completa para extirpar cada ORF que se muestra. La Figura 11 muestra una digestión típica, en este caso una vista lineal del plásmido pBR322. Si la secuencia de ADN original es circular, entonces se ofrecen tanto visualizaciones lineales como circulares. A partir de la visualización inicial hay muchas opciones para ir más allá, incluyendo la digestión personalizada con enzimas de su elección y varias visualizaciones de la digestión. También es posible, desde las visualizaciones lineales, ampliar una región seleccionada de la secuencia para obtener una vista más detallada. Una de las opciones permite seleccionar una región concreta y mostrar las enzimas que cortan justo al lado de la región. Esto es útil para encontrar enzimas capaces de cortar la región deseada. Si el zoom lleva a una región de <60 nucleótidos, entonces se muestra la secuencia real (Fig. (Fig.2),2), junto con cualquier traducción que sea apropiada. En esta pantalla se muestran todas las enzimas que cortan la secuencia, se resaltan todas las bases que forman parte de una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción y al mover el ratón sobre el nombre de una enzima se produce un recuadro con la secuencia de reconocimiento anotada y la propia secuencia se subraya en la pantalla.
La visualización lineal de un digesto del plásmido pBR322. Obsérvese que los dos ORF principales están flanqueados por sitios (MseI y PflMI; BspHI y EarI) que podrían utilizarse para extirparlos de la secuencia completa del plásmido. En esta visualización sólo se muestran las enzimas que escinden la secuencia una vez. Las opciones para una mayor digestión y visualización están disponibles a través de los botones en la parte inferior de la pantalla.
Visualización ampliada de una región corta de pBR322. Obsérvese que las bases resaltadas en rojo y azul forman parte de los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción. Las rojas son inequívocas, mientras que las azules son bases degeneradas. Así, BsiEI reconoce la secuencia CGRYCG. Los residuos CG exteriores son invariables, mientras que las bases interiores son degeneradas y, en la secuencia específica mostrada, son GT. Las bases mostradas en negro no forman parte de ningún sitio de reconocimiento de enzimas de restricción. Esta pantalla puede ser útil para encontrar enzimas de restricción capaces de distinguir los alelos del SNP.
En cualquier pantalla principal, al mover el ratón sobre el nombre de una enzima de restricción se mostrará su secuencia de reconocimiento y el número de base preciso en el que se escinde. Si hay más de un sitio para la enzima, todos los demás sitios están subrayados. Al hacer clic en el nombre de la enzima aparecerá una página con un resumen de información sobre la enzima, incluyendo su sensibilidad a la metilación, los tipos de extremos producidos, los isosquizómeros disponibles y una lista de otras enzimas que pueden producir extremos compatibles. Para las enzimas de NEB, se proporciona información sobre las condiciones de digestión y un enlace al sitio web de NEB.
Una característica clave de NEBcutter es que incorpora todo lo que está registrado en REBASE sobre la sensibilidad a la metilación de cualquiera de las enzimas mostradas cuando se superponen a un sitio Dam (GATC), un sitio Dcm (CCWGG), un sitio CpG, un sitio EcoKI (AACN6GTGC) o un sitio EcoBI (TGAN8TGCT). Cuando se realizan digestiones teóricas, los resultados incluyen una comparación de los efectos de la metilación resaltando las bandas que se desplazan (Fig. (Fig.33).
Una digestión teórica que muestra los efectos de la metilación Dcm superpuesta en los sitios MscI (secuencia de reconocimiento: TGGCCA) presentes en la secuencia si el bacteriófago lambda se hubiera cultivado en una cepa de E.coli que expresa la metiltransferasa Dcm (secuencia de reconocimiento: CCWGG). Los fragmentos afectados por la metilación Dcm se muestran en rojo. El gel virtual se basa en la interpolación de una curva spline cúbica generada a partir de datos experimentales producidos con fragmentos de tamaño conocido.
En cada página se proporcionan enlaces directos que llevan de vuelta a la página principal, proporcionan ayuda para interpretar la visualización o permiten a los usuarios enviar comentarios a los autores. La interfaz ha sido diseñada para ser lo más intuitiva posible y proporcionar un fácil acceso a las principales funciones útiles para los investigadores que intentan escindir su ADN. La versión actual de NEBcutter ha procesado más de 400 000 secuencias de usuarios. Actualmente estamos preparando una serie de mejoras para NEBcutter y la versión 2.0 está prevista para el 1 de julio.