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El mantenimiento de la estabilidad genómica es esencial para prevenir la muerte celular indebida o la neoplasia (Cassidy y Venkitaraman, 2012). Las lesiones críticas del ADN, como las roturas de doble cadena (DSB), activan la respuesta al daño del ADN (DDR), una amplia red de señalización que implica la reparación del ADN, la activación de los puntos de control del ciclo celular y una amplia modulación de la expresión génica y de muchas vías metabólicas (Ciccia y Elledge, 2010; Hiom, 2010). Los DSBs son inducidos por la radiación ionizante, los productos químicos radiomiméticos y los radicales de oxígeno endógenos. Acompañan al estancamiento de la horquilla de replicación y se forman y resellan en la recombinación meiótica y en el reordenamiento de los genes receptores de antígenos durante el desarrollo del sistema inmunitario. Las principales vías de reparación de las DSB son la unión de extremos no homólogos (NHEJ) propensa a errores o la reparación de recombinación homóloga de alta fidelidad (HRR; Holthausen et al., 2010; Lieber, 2010). La amplia y potente red de señalización evocada por las DSBs comienza con la rápida acumulación en los sitios de las DSBs de un gran grupo de proteínas apodadas «sensores» o «moderadores» y continúa con la activación de varias proteínas quinasas («transductores») con funciones parcialmente redundantes que retransmiten la señal a numerosos efectores aguas abajo, que suelen ser actores clave en las distintas ramas de la DDR (Lovejoy y Cortez, 2009; Ciccia y Elledge, 2010; Lukas et al., 2011).
El principal transductor de la alarma DSB es la serina-treonina quinasa ataxia telangiectasia (A-T) mutada (ATM; Banin et al., 1998; Canman et al., 1998), que se activa en respuesta a la inducción de la DSB (Bakkenist y Kastan, 2003) y pasa a fosforilar una plétora de sustratos (Matsuoka et al., 2007; Bensimon et al., 2010). ATM pertenece a una familia conservada de proteínas quinasas similares a la fosfoinositida 3 (PIKKs) que incluye, entre otros, otros dos importantes transductores de DDR: la subunidad catalítica de la proteína quinasa dependiente del ADN (DNA-PKcs) y ATR (ataxia telangiectasia y Rad3 related). Estas tres quinasas mantienen estrechas relaciones funcionales (Lovejoy y Cortez, 2009). Evidencias recientes sugieren que la amplia capacidad de ATM como proteína quinasa le permite regular otros procesos, como los niveles de estrés oxidativo (Guo et al., 2010), y desempeñar un papel en arenas citoplasmáticas no DDR, entre ellas la homeostasis mitocondrial (Yang et al., 2011; Valentin-Vega y Kastan, 2012; Valentin-Vega et al., 2012).
Las mutaciones de la línea germinal humana que anulan las respuestas celulares al daño del ADN causan graves síndromes de inestabilidad genómica (Jeppesen et al., 2011). El gen ATM está mutado en el síndrome de inestabilidad genómica, A-T (Savitsky et al., 1995). A-T se caracteriza por una neurodegeneración progresiva, inmunodeficiencia, predisposición al cáncer, inestabilidad genómica y sensibilidad a los agentes inductores de DSB (McKinnon, 2012). La enfermedad está causada por mutaciones nulas de ATM, y los pacientes suelen presentar una pérdida completa de la proteína ATM (Gilad et al., 1996).
Los estudios de los procesos dependientes de ATM suelen basarse en células humanas de tipo salvaje frente a las de A-T, en el derribo de ATM mediante ARNi, en la reconstitución de células deficientes en ATM mediante la expresión ectópica de la proteína ATM de tipo salvaje o muerta por quinasa, o en el tratamiento de células cultivadas con inhibidores de ATM. Los laboratorios que utilizan estos sistemas experimentales han considerado durante mucho tiempo que las consecuencias fisiológicas de la pérdida de ATM en contraposición a albergar ATM inactiva pueden no ser similares (Choi et al., 2010). Los trabajos de Daniel et al. y Yamamoto et al. (ambos en este número) proporcionan pruebas sólidas de esta noción y marcan un punto de inflexión en nuestra visión del modo de funcionamiento de ATM. Ambos trabajos se basan en la manipulación del gen Atm en el ratón.
Los ratones knockout de Atm existen desde hace tiempo. Estos ratones presentan la mayoría de los síntomas de la A-T, incluyendo el bajo peso corporal, la esterilidad, la radiosensibilidad y la predisposición al cáncer, pero la neurodegeneración es considerablemente menos marcada en estos animales en comparación con la observada en los pacientes humanos de A-T (Barlow et al., 1996; Elson et al., 1996; Xu et al., 1996; Borghesani et al., 2000). Así, antes de la aparición del cáncer y sin exposición a la radiación, el fenotipo murino Atm-/- es relativamente moderado. Utilizando la expresión de transgenes mutantes de Atm en un fondo Atm-/- (Daniel et al., 2012) y mediante knockin directo (Yamamoto et al., 2012), los dos grupos generaron nuevas cepas de ratones que carecen de actividad de Atm; en lugar de estar desprovistos de Atm, estos animales expresan niveles fisiológicos de proteína catalíticamente inactiva (quinasa muerta). Sorprendentemente, en ambos laboratorios, este genotipo condujo a una letalidad embrionaria temprana, con una inestabilidad genómica inherente mayor que la observada en los animales Atm-/- (Fig. 1). La expresión condicional de la proteína mutante en el sistema inmunitario redujo la eficiencia de la recombinación V(D)J (variable, diversidad y unión) y el cambio de clase de inmunoglobulina, dos procesos que implican la vía NHEJ de reparación de DSB y que requieren una ATM activa para su funcionamiento óptimo. Sin embargo, esta reducción fue comparable a la causada por la ausencia de Atm. En conjunto, los datos de ambos laboratorios sugieren que la vía HRR de reparación de DSB, más que la NHEJ, puede verse afectada en mayor medida por la presencia de Atm inactiva en comparación con el efecto obtenido tras la pérdida de Atm.
Comparación fenotípica de genotipos de Atm de ratón. Los ratones que expresan una proteína inactiva como única fuente de Atm mueren en el útero (Daniel et al., 2012; Yamamoto et al. 2012). Los heterocigotos se parecen a los animales de tipo salvaje (WT), lo que indica la ausencia de un efecto dominante-negativo. HRR, reparación de recombinación homóloga; kd, quinasa muerta.
Este dramático fenotipo es presumiblemente causado por un mal funcionamiento severo del DDR, atestiguando una vez más su importancia en el desarrollo temprano. El papel crítico del DDR en el desarrollo ha sido documentado en el pasado (Phillips y McKinnon, 2007), pero la novedad de los estudios actuales radica en la profunda diferencia entre la pérdida de Atm y la presencia de Atm catalíticamente inactiva. Lo mismo probablemente se aplica en los seres humanos también: Los pacientes con A-T suelen presentar pérdida de ATM, y en los raros casos de ATM catalíticamente inactiva en los pacientes, su nivel es lo suficientemente bajo como para permitir la viabilidad. Una observación similar fue hecha recientemente por Zhang et al. (2011) con otro miembro de la familia PIKK-ADN-PKcs. Este grupo descubrió que los ratones que expresan una versión mutante de DNA-PKcs, que carece de tres sitios de fosforilación asociados a su activación, mueren poco después de nacer como consecuencia de un fallo en la médula ósea. Es interesante observar que, en contraste con esto, la abolición de tres sitios de fosforilación en Atm de ratón, cuyos equivalentes en ATM humana se fosforilan durante su activación (Bakkenist y Kastan, 2003; Kozlov et al., 2006), no dio lugar a ningún fenotipo discernible (Pellegrini et al., 2006; Daniel et al., 2008).
Parece, por tanto, que la presencia de niveles fisiológicos de Atm inactiva interfiere gravemente en el DDR, ciertamente más que su ausencia. ¿Por qué podría ser esto? Aunque se desconoce el mecanismo exacto de este fenómeno, se pueden hacer algunas suposiciones. ATM se recluta en los sitios de DSB (Andegeko et al., 2001) y por lo tanto está presente en los enormes focos nucleares que abarcan estos sitios. Muchas fosforilaciones mediadas por ATM ocurren dentro de estos conglomerados de proteínas. Es importante destacar que Daniel et al. (2012) y Yamamoto et al. (2012) descubrieron que el reclutamiento de Atm muerto por la quinasa a los sitios de daño en el ADN ocurre normalmente. Es posible que la presencia de Atm catalíticamente inactiva dentro de estos centros DDR perturbe gravemente la capacidad de la célula para responder al daño. Presumiblemente, interfiere con la dinámica temporal ordenada de los eventos dentro de estas fábricas de proteínas (Lukas et al., 2011). Un conocimiento más profundo de la organización espacial de estos ensamblajes de proteínas (Chapman et al., 2012) y de la jerarquía temporal de los eventos dentro de ellos puede dilucidar el papel de ATM no sólo como una enzima sino también como una fracción de proteína en estas estructuras. Cabe destacar que ATM es una gran proteína de 3.056 residuos, de los cuales ∼10% constituyen su sitio activo. Las funciones reguladoras del 90% restante de este polipéptido son en gran medida esquivas. En un sentido más amplio, estos estudios demuestran de forma convincente, a nivel de organismo, que la pérdida de una enzima frente a tenerla residiendo inactiva en la célula pueden ser mundos aparte. En este contexto, sería interesante vigilar el desarrollo de tumores malignos en aquellos animales que expresan la Atm mutante en su sistema linfoide. Esto es especialmente importante porque las neoplasias malignas observadas en los ratones Atm-/-, similares a las de los pacientes con A-T, son principalmente linfoides.
Las implicaciones para la investigación traslacional relacionada con ATM son notables. Naturalmente, la ATM se ha considerado una diana potencial a inactivar en las células tumorales para sensibilizarlas selectivamente a la radioterapia (Begg et al., 2011; Basu et al., 2012; Golding et al., 2012). La aparición de inhibidores eficientes de la ATM (Hickson et al., 2004; Golding et al., 2009) ha estimulado aún más estas esperanzas. La buena noticia es que el efecto de estos inhibidores en la radiosensibilidad celular (y, probablemente, en el bienestar general) podría ser más profundo de lo que se estimaba anteriormente, siempre que estas pequeñas moléculas pudieran dirigirse específicamente a las células malignas. Por otra parte, la exposición de los tejidos corporales normales en proliferación a los inhibidores de la ATM puede ser indeseable, dependiendo del tipo de tejido. Dicha exposición de los tejidos normales a la inhibición de la ATM, aunque sea breve, podría conducir a una inestabilidad genómica sustancial, una fuerza motriz potencial hacia una nueva malignidad.