El dogma central de la biología molecular es ADN→ARN→Proteína. Para sintetizar una proteína concreta, el ADN debe transcribirse primero en ARN mensajero (ARNm). A continuación, el ARNm puede traducirse en el ribosoma en cadenas polipeptídicas que constituyen la estructura primaria de las proteínas. A continuación, la mayoría de las proteínas se modifican mediante una serie de modificaciones postraduccionales que incluyen el plegado de la proteína, la formación de puentes disulfuro, la glicosilación y la acetilación para crear proteínas funcionales y estables. La expresión de proteínas se refiere al segundo paso de este proceso: la síntesis de proteínas a partir del ARNm y la adición de modificaciones postraduccionales

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Los investigadores utilizan varias técnicas para controlar la expresión de proteínas para aplicaciones experimentales, biotecnológicas y médicas. Los investigadores pueden visualizar las proteínas in vivo marcándolas con proteínas fluorescentes para estudiar su localización o purificarlas para estudiar su estructura, interacciones y funciones. Las proteínas también pueden purificarse para su uso en la investigación de la biología molecular (por ejemplo, las polimerasas y otras enzimas podrían purificarse y utilizarse para manipular el ADN), o en medicina (por ejemplo, la insulina).

Las proteínas, a diferencia del ADN que puede sintetizarse con relativa facilidad, deben producirse utilizando mezclas complejas derivadas de células o utilizando células vivas. Existen varios tipos de sistemas de expresión utilizados para la producción y purificación de proteínas. Entre ellos se encuentran los sistemas de expresión de mamíferos, insectos, bacterias, plantas, levaduras y células libres.

En general, la estrategia para la expresión de proteínas consiste en transfectar células con la plantilla de ADN de su elección y permitir que estas células transcriban, traduzcan y modifiquen su proteína de interés. Las proteínas modificadas pueden entonces extraerse de las células lisadas mediante el uso de etiquetas proteicas y separarse de los contaminantes utilizando una variedad de métodos de purificación. Decidir qué sistema de expresión utilizar depende de varios factores:

1. La proteína que se intenta expresar
2. La cantidad de proteína que se necesita
3. Sus planes para las aplicaciones posteriores

En esta entrada del blog resumiremos algunos de los sistemas de expresión más comunes, incluyendo sus ventajas y advertencias a tener en cuenta antes de elegir un sistema.

Sistemas de expresión de mamíferos

Las células de mamíferos son un sistema ideal para la expresión de proteínas de mamíferos que requieren múltiples modificaciones de post-traducción para la correcta función de la proteína. La mayoría de las construcciones de ADN diseñadas para la expresión en mamíferos utilizan promotores virales (SV40, CMV y RSV) para una expresión robusta después de la transfección. Los sistemas de mamíferos pueden expresar proteínas tanto de forma transitoria como a través de líneas celulares estables. Ambos métodos producen altos rendimientos de proteínas si la transfección es exitosa.

Algunos sistemas de mamíferos también permiten controlar cuándo se expresa una proteína mediante el uso de promotores constitutivos e inducibles. Los promotores inducibles son extremadamente útiles si un producto proteico deseado es tóxico para las células a altas concentraciones. A pesar de sus ventajas, los sistemas de expresión de mamíferos requieren condiciones de cultivo celular exigentes en comparación con otros sistemas.

Sistemas de expresión de insectos

Las células de insectos también pueden utilizarse para producir proteínas eucariotas complejas con las modificaciones postraduccionales correctas. Hay dos tipos de sistemas de expresión de insectos; células de insectos infectadas por baculovirus y células de insectos no líticas.

Los sistemas de expresión de baculovirus son muy potentes para la expresión de proteínas recombinantes de alto nivel. Estos sistemas permiten una alta expresión de proteínas muy complejas y glicosiladas que no pueden producirse en células de E. coli o de levadura. El único problema de los sistemas de baculovirus es que la célula huésped infectada acaba siendo lisada. La lisis de la célula detiene la producción de proteínas, pero hay sistemas de expresión de células de insecto no líticas (células sf9, Sf21, Hi-5) que permiten la expresión continua de genes integrados en el genoma de la célula de insecto. Ambos tipos de sistemas de expresión de insectos pueden ampliarse para la producción de grandes cantidades de proteínas.

Algunos de los inconvenientes de los sistemas de expresión de células de insecto son que la producción de virus puede llevar bastante tiempo y que las células de insecto requieren condiciones de cultivo exigentes similares a las de los sistemas de expresión de mamíferos.

Sistemas de expresión bacteriana

Cuando se quiere producir grandes cantidades de proteínas de forma rápida y barata, una célula huésped bacteriana es casi siempre la respuesta. E. coli es definitivamente uno de los anfitriones más populares para la expresión de proteínas con varias cepas que se especializan para la expresión de proteínas. La expresión de proteínas en bacterias es bastante sencilla: el ADN que codifica la proteína de interés se inserta en un vector de expresión plasmídico que se transforma en una célula bacteriana. Las células transformadas se propagan, se inducen para producir la proteína de interés y luego se lisan. La proteína puede entonces purificarse a partir de los restos celulares.

Hay varios vectores de ADN populares que pueden utilizarse para producir grandes cantidades de proteína en células bacterianas: los vectores pET, pRSET, Gateway pDEST y pBAD, por ejemplo. La expresión de la proteína de cada uno de estos vectores está controlada por un promotor diferente, lo que resulta en diferentes niveles de expresión de cada vector; se puede requerir una menor expresión si su proteína es tóxica para E. coli. De todos los vectores, el pET, bajo el control del promotor T7 lac e inducido por la lactosa, proporciona el mayor nivel de expresión de la proteína.

A pesar de su facilidad de uso, es importante señalar que las bacterias normalmente no pueden producir proteínas funcionales multidominio de mamíferos, ya que las células bacterianas no están equipadas para añadir las modificaciones postraduccionales adecuadas. Además, muchas proteínas producidas por bacterias se vuelven insolubles, formando cuerpos de inclusión que son difíciles de extraer sin reactivos duros y sin paciencia.

Sistemas de expresión vegetal

Las plantas proporcionan un medio barato y de baja tecnología para la expresión masiva de proteínas recombinantes. Se han utilizado muchas células de varios tipos de plantas, como el maíz, el tabaco, el arroz, la caña de azúcar e incluso los tubérculos de las patatas, para la expresión de proteínas.

Los sistemas vegetales comparten muchas de las mismas características y requisitos de procesamiento que los sistemas de expresión de células de mamíferos, incluyendo la mayoría de las modificaciones postraduccionales complejas. Sin embargo, la extracción y purificación de proteínas recombinantes a partir de plantas puede ser costosa y requerir mucho tiempo, ya que los propios tejidos vegetales son bioquímicamente complejos.

Para evitar estos problemas, los científicos han aprovechado la secreción natural de bioquímicos y proteínas a través de las raíces de las plantas. Marcar las proteínas recombinantes con un péptido vegetal secretado de forma natural permite un acceso y una purificación más fáciles de la proteína deseada. A pesar de ser una tecnología bastante incipiente, las células vegetales se han utilizado para expresar una amplia gama de proteínas, incluyendo anticuerpos y productos farmacéuticos, concretamente interleucinas.

Sistemas de expresión de levadura

La levadura es un gran sistema de expresión para generar grandes cantidades de proteínas eucariotas recombinantes. Aunque se pueden utilizar muchas especies de levadura para la expresión de proteínas, S. cerevisiae, es la especie más fiable y frecuentemente utilizada debido a su uso como organismo modelo en genética y bioquímica.

Cuando se utiliza S. cerevisiae, los investigadores suelen colocar las proteínas recombinantes bajo el control del promotor inducible por galactosa (GAL). Otros promotores comúnmente utilizados son los promotores inducibles por fosfato y cobre PHO5 y CUP1 respectivamente. Las células de levadura se cultivan en medios bien definidos y pueden adaptarse fácilmente a la fermentación, lo que permite la producción de proteínas a gran escala y de forma estable.

En general, los sistemas de expresión de la levadura son más fáciles y baratos de trabajar que las células de mamífero, y suelen ser capaces de modificar proteínas complejas, a diferencia de los sistemas bacterianos. Sin embargo, las células de levadura tienen una tasa de crecimiento más lenta que las células bacterianas y las condiciones de crecimiento a menudo deben ser optimizadas. Las células de levadura también son conocidas por hiperglucosilar proteínas, lo que puede ser un problema dependiendo de la proteína que se elija.

Sistemas de expresión sin células

En los sistemas de expresión sin células, las proteínas se ensamblan in vitro utilizando componentes purificados de la maquinaria de transcripción y traducción. Estos incluyen ribosomas, ARN polimerasa, ARNt, ribonucleótidos y aminoácidos. Los sistemas de expresión sin células son ideales para ensamblar rápidamente más de una proteína en una reacción. Una de las principales ventajas de estos sistemas es su capacidad para ensamblar proteínas con aminoácidos marcados o modificados que son útiles en diferentes aplicaciones posteriores. Sin embargo, los sistemas de expresión sin células son caros y muy difíciles de utilizar desde el punto de vista técnico.

Alyssa D. Cecchetelli es científica en Addgene. Se doctoró en la Northeastern University y está especialmente interesada en la señalización y la comunicación celular. Le encanta poder ayudar a la comunidad científica a compartir plásmidos.

Recursos adicionales

• Sistemas de expresión de proteínas de Thermofisher
• Expresión de proteínas recombinantes en Escherichia coli: avances y desafíos
• Producción de proteínas recombinantes en exudados de raíces de plantas

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