Mejora de la calidad de los espermatozoides en el semen hiperviscoso tras el tratamiento con DNasa I
Abstract
La hiperviscosidad del semen perjudica la motilidad de los espermatozoides y puede provocar infertilidad masculina. Este estudio prospectivo pretendía evaluar la capacidad de la DNasa exógena para mejorar la calidad del esperma, teniendo en cuenta que la DNasa se ha encontrado en el plasma seminal de varias especies y que los neutrófilos liberan cromatina para atrapar bacterias. En este análisis se compararon un total de setenta y siete muestras de semen con alta viscosidad seminal (HSV) como grupo de estudio y sesenta y dos muestras de semen con viscosidad seminal normal (NSV) como grupo de control. Estas muestras de semen se dividieron en tres grupos que recibieron tratamiento (a) con DNasa I a 37°C durante 15 minutos, (b) mediante centrifugación en gradiente de densidad, y (c) con una combinación de los dos métodos anteriores. Tras un tratamiento de quince minutos del semen hiperviscoso, la motilidad de los espermatozoides en el 83% de las muestras de semen aumentó en un grado estadísticamente significativo. Por el contrario, el tratamiento con DNasa del semen con viscosidad normal no tuvo tales efectos. El tratamiento anterior se acompañó también de un aumento significativo del porcentaje de espermatozoides normales, lo que dio lugar a una importante disminución del índice de teratozoospermia. La comparación entre las muestras de semen que se sometieron a la centrifugación en gradiente de densidad tras el tratamiento con DNasa I, y las recogidas tras el tratamiento en gradiente de densidad únicamente, mostró que en el primer caso los resultados fueron más espectaculares. La evaluación de cada preparación en términos de rendimiento (% total de espermatozoides progresivamente móviles después del tratamiento en relación con el recuento total inicial de espermatozoides) reveló que el enfoque combinado dio lugar a un 29,8% frente al 18,5% con el tratamiento de densidad solo (p=0,0121). El tratamiento con DNasa I produce una mejora de la motilidad y la morfología de los espermatozoides y podría ser beneficioso para los hombres con semen hiperviscoso en los protocolos de reproducción asistida.
1. Introducción
Los estudios han documentado que la hiperviscosidad del semen (SHV) se produce en el 12-29% de los eyaculados . La hiperviscosidad es una condición que puede dar lugar a la infertilidad masculina , ya que puede alterar seriamente las características físicas y químicas del líquido seminal . Se ha asociado a una reducción de la movilidad de los espermatozoides, así como a un mal resultado de la fecundación in vitro y a un aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, los niveles de productos de daño oxidativo seminal se han correlacionado significativamente con la viscosidad del líquido seminal en varones infértiles.
Hay fuertes indicios de la existencia de vías inhibitorias que deterioran la calidad del esperma a través de la producción de ERO durante el transporte de los espermatozoides a través del tracto genital masculino , indicios de daño espermático durante la manipulación y el almacenamiento en el laboratorio , pero también indicios de producción adicional de ERO «automáticamente» después de la eyaculación, al menos en algunos casos de hiperviscosidad seminal . Esta condición se asocia sobre todo con la infección de las glándulas sexuales accesorias masculinas y el varicocele , aunque la fisiopatología todavía no se entiende completamente. Además, se ha detectado un deterioro de la capacidad antioxidante del líquido seminal en muestras oligoastenozoospermicas en casos de hiperviscosidad seminal . Además, los niveles excesivamente generados de ROS engendran una peroxidación lipídica que altera la morfología de la membrana. La presencia de niveles elevados de leucocitos en el semen se asocia con el SHV . Además, los leucocitos son una fuente importante de ROS y de vectores de retrovirus en el semen, mientras que su presencia se ha asociado a una menor probabilidad de concepción, así como a una menor tasa de éxito de la inseminación intrauterina (IIU) y de la FIV convencional. Además, el SHV se correlaciona con la composición de la microbiota seminal y la mayor prevalencia de bacterias patógenas.
Se han propuesto varios enfoques terapéuticos para reducir la viscosidad del semen SHV. La sobrehidratación y el masaje prostático no fueron eficaces. La aspiración y la expulsión suave del semen, a través de una jeringa de 5 ml, son casi ineficaces ya que el SHV no es un fenómeno mecánico . La proteólisis mediante el uso de quimotripsina mejora el manejo del semen hiperviscoso aunque se producen algunas alteraciones en las proteínas del esperma . Teniendo en cuenta que tal procedimiento puede dañar la estructura de los espermatozoides y que en la mayoría de los casos el SHV se correlaciona con la leucocitospermia , planteamos la hipótesis de que el SHV es causado por las trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) y que son sensibles a la degradación del ADN a través de la DNasa I. Hasta donde sabemos este es el primer informe del uso de la DNasa I, con el fin de abordar el SHV.
2. Materiales y Métodos
2.1. Participantes
Se realizó un estudio prospectivo durante 3 años en pacientes con antecedentes de infertilidad en la Clínica Médica de Atenas, Locus Medicus, con los siguientes criterios de exclusión: hipogonadismo varicocele, criptorquidia y obstrucción congénita de los conductos seminales. Se obtuvieron setenta y siete muestras de semen con VHS como grupo de estudio y sesenta y dos muestras de semen normales con VNS como grupo de control, estratificadas como sigue. Inicialmente, un conjunto de treinta y dos muestras de semen con VHS y diez muestras de semen con VNS fueron tratadas con DNasa I. Además, otro conjunto de veintiséis muestras de semen con VHS y cincuenta y dos con VNS fueron procesadas por el método de centrifugación en gradiente de densidad (DGC). Por último, diecinueve muestras de VHS se procesaron mediante una combinación de los métodos, es decir, tratamiento inicial con DNasa I, seguido de DGC. Todos los participantes firmaron un formulario de consentimiento informado antes de cualquier participación.
2.2. Análisis de semen
Las muestras de semen, obtenidas por masturbación tras una abstinencia sexual de 3 a 5 días, se colocaron en recipientes estériles. Tras la recogida, las muestras de semen se dejaron licuar a 37°C y luego se sometieron a los límites de referencia del análisis de semen convencional, antes y después del proceso combinado descrito anteriormente]. La motilidad fue evaluada por el mismo biólogo con formación oficial (ESHRE), que no participa en el estudio. La presencia de glóbulos blancos (WBC) se evaluó mediante una prueba de peroxidasa (Leukoscreen FertiPro; Bélgica) según las directrices de la OMS de 2010 . Aunque la viscosidad podía evaluarse mediante un viscosímetro cuantitativo, la viscoelasticidad del semen se estimó utilizando pipetas de plástico desechables que dejaban caer el semen por gravedad y observando la longitud de cualquier hilo . Los hombres cuyo semen tiene una longitud de hilo entre 2 cm y 4 cm se clasifican como SHV leve (53,12%); una longitud de hilo entre 4 cm y 6 cm (40,62%) se etiqueta como SHV moderado; y una longitud de hilo superior a 6 cm se diagnostica como SHV grave (6,25%) se incluyeron en el grupo de alta viscosidad (HV), mientras que la viscoelasticidad se consideró normal cuando la longitud de hilo era de 2 cm o menos.
2.3. Tratamiento con enzimas
Se evaluó el efecto de la DNasa I en muestras de semen normales y de alta viscosidad. Tras la licuefacción, la DNasa I se introdujo suavemente en el recipiente estéril con la muestra de semen hasta alcanzar una concentración final de 20 U/ml y se mezcló constantemente, tras lo cual se incubó a 37°C durante entre 15 y 60 minutos. Se analizaron la motilidad y la morfología de las muestras de semen anteriores antes y después de la digestión enzimática y se evaluó el % de PR (motilidad de (a+b) % del recuento total de espermatozoides) de los espermatozoides antes de cualquier tratamiento (es decir, el % inicial de PR).
2.4. Preparación del semen
El método de centrifugación en gradiente de densidad (DGC) se realizó según las recomendaciones del fabricante. El gradiente de densidad se preparó colocando en capas 1 ml de medio al 40% sobre el medio al 80% PureSperm® (Nidacon International, Gotemburgo, Suecia) en un tubo de centrífuga cónico de 15 ml. El semen se colocó en la parte superior del gradiente y se centrifugó a 300 g durante 20 minutos. La extensión y la fuerza de la centrifugación pueden variarse en función de la calidad de la muestra: por ejemplo, el tiempo de centrifugación puede aumentarse en el caso de muestras con alta viscosidad. Después de la centrifugación, hay que eliminar suavemente la mayor parte del sobrenadante y colocar el pellet en un tubo nuevo y limpio y resuspenderlo bien en 5 ml de medio para eliminar el medio de gradiente de densidad. A continuación, se centrifuga a 200 g durante 10 minutos, se elimina el sobrenadante y el pellet final se resuspende en el medio estéril para las tecnologías de reproducción asistida (TRA). Por último, en el tratamiento combinatorio, las muestras con alta viscosidad se trataron inicialmente con DNasa I y luego se prepararon con el método DGC descrito anteriormente. Se determinó la concentración, la motilidad y la morfología antes y después de la preparación.
Teniendo en cuenta que el recuento total de espermatozoides progresivamente móviles después del lavado (TPMSC) podría ser útil para predecir la eficacia de la inseminación intrauterina, el rendimiento de cada método también se evaluó de la siguiente manera: el porcentaje de TPMSC después del tratamiento, ya sea con la preparación DGC o DNasa I o con el tratamiento combinado de DNasa I seguido de la preparación DGC, se dividió por el número de espermatozoides totales antes del tratamiento. Además, el resultado del rendimiento (es decir, el % de RP final/espermatozoides totales antes) se comparó con el % de RP inicial/espermatozoides totales antes de cualquier tratamiento. El rendimiento se evaluó en muestras de semen con una viscosidad alta o normal. Aunque no hay consenso sobre el número de espermatozoides móviles administrados en las TRA, se acepta generalmente que la recuperación del número máximo de espermatozoides móviles de cada muestra de semen después de cualquier tratamiento es de gran importancia.
2.5. Análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis utilizando el GraphPad Prism 6.0. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
La concentración de glóbulos blancos (WBC) se muestra en la Figura 1. Existe una diferencia estadísticamente significativa entre todos los grupos (p=0,0238 ANOVA de una vía). Además, la diferencia estadística dentro del grupo HV es de 0,0018.
Concentración de glóbulos blancos (106/ml) en función de la longitud de hilo de la viscosidad (leve, moderada y grave) como el grupo HV; w/o V: semen sin viscosidad.
El uso de DNasa I aumenta la motilidad de los espermatozoides en los hombres (32 sujetos) con alta viscosidad. Como muestra la figura 2(a), la adición de la enzima durante quince minutos (t=15) mejora el porcentaje de movimiento (a) del 2,875% de espermatozoides al 8,094% de espermatozoides inmediatamente después de la licuefacción (t=0), lo cual es estadísticamente significativo (p=0,049, prueba de comparación múltiple). Además, el movimiento de la RP entre los mismos puntos temporales aumentó del 27,468% a un 46,59% estadísticamente significativo (p<0,0001, prueba de comparación múltiple). Al mismo tiempo, la motilidad de la fracción (c) disminuyó del 34,687% (t=0) al 21,5% (t=15) (p<0,0001, prueba de comparación múltiple) mientras que la motilidad de la fracción (d) disminuyó del 37,812% (t=0) al 31,968% (t=15) (p=0,45 prueba de comparación múltiple). El uso de DNasa I en el semen con viscosidad normal no aumenta la motilidad de los espermatozoides de manera estadísticamente significativa, en ninguna muestra, como se muestra en la Figura 2(b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Efectos de la DNasa I en la motilidad de los espermatozoides tras 15 minutos de incubación con DNasa I. La DNasa I mejora el movimiento de la RP de forma estadísticamente significativa en el semen hiperviscoso (a) pero no tiene efecto en los espermatozoides con viscosidad normal (b). c/o: espermatozoides sin tratamiento, tratado: espermatozoides tratados con DNasa I, a: espermatozoides de progresión rápida, b: espermatozoides de progresión lenta, c: no progresivos, d: inmóviles, y PR: motilidad de (a+b).
La continuación de la incubación durante quince minutos adicionales (en 21 sujetos de 32) (para un tiempo total de treinta minutos, t=30) aumentó la motilidad de una fracción de espermatozoides hasta el 9,524% (t=30) desde el 1,761% (t=0) (p=0,046, prueba de comparación múltiple) como se demuestra en la Figura 3. Curiosamente, el movimiento de la RP mejoró drásticamente del 24% (t=0) al 45,047% (t=30) (p<0,0001, prueba de comparación múltiple) de los espermatozoides. La motilidad de la fracción (c) y (d) de los espermatozoides disminuyó de forma estadísticamente significativa del 35,714% al 22,08% (p=0,001, prueba de comparación múltiple) y del 40,238% al 32,238% (p=0,039, prueba de comparación múltiple), respectivamente. La reevaluación de la viscosidad de los espermatozoides después del tratamiento con DNasa I mostró que en la mayoría de los casos la viscosidad se ha normalizado o al menos ha mejorado.
Efectos de la DNasa I en la motilidad del semen hiperviscoso después de 30 minutos de incubación con DNasa I. La DNasa I mejora el movimiento de forma estadísticamente significativa en el semen hiperviscoso pero de forma menos espectacular que la incubación de quince minutos. w/o: espermatozoides sin tratamiento, tratado: espermatozoides tratados con DNasa I, a: espermatozoides rápidamente progresivos, c: no progresivos, d: inmóviles, y PR: motilidad de (a+b).
A continuación, comparamos los resultados de los espermatozoides sometidos a centrifugación en gradiente de densidad tras el tratamiento con DNasa I, con los encontrados tras el tratamiento en gradiente de densidad únicamente. Debido a los límites de las muestras, los dos procedimientos no se utilizaron en muestras obtenidas de los mismos sujetos, sino en muestras de sujetos diferentes cuya viscosidad espermática era elevada. El tratamiento de centrifugación en gradiente de densidad se empleó también para la inseminación intrauterina (IIU). Como se muestra en la figura 4, el porcentaje de (a) movimiento después de la centrifugación en gradiente de densidad tras el tratamiento con DNasa I aumentó del 3,416% al 35,083% de los espermatozoides (una mejora de 10,27 veces) en comparación con el 6,333% al 26,866% de los espermatozoides (una mejora de 4,242 veces) en el caso del tratamiento en gradiente de densidad solo (p<0,0001, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple). En cuanto al movimiento (b), tras la centrifugación en gradiente de densidad después del tratamiento con DNasa I, la mejora también fue estadísticamente significativa (del 28,583% al 40,916% de los espermatozoides (un aumento de 1,43 veces), p=0,0112). En el grupo de tratamiento de centrifugación en gradiente de densidad, la mejora respectiva aumentó del 34,533% al 46,466% de los espermatozoides (una mejora de 1,34 veces), aunque la diferencia entre los grupos no fue estadísticamente significativa (ns, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple). Además, el movimiento de la RP en el primer grupo aumentó del 32% al 76% de los espermatozoides (2,375 veces) en comparación con una mejora de 1,776 veces en el segundo grupo (del 40,866% al 72,666% de los espermatozoides) (no significativa estadísticamente entre los grupos, prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis). La motilidad de la fracción (c) y (d) de los espermatozoides disminuyó del 36,083% al 10,583% y del 31,916% al 13,583%, respectivamente. La disminución respectiva en el grupo de tratamiento de centrifugación en gradiente de densidad solo fue del 29,40% al 14,80% (no es estadísticamente significativa entre los grupos, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple).
Comparación entre DGC tras el tratamiento con DNasa I frente a DGC solo en la motilidad del semen hiperviscoso. El tratamiento combinado tuvo mayor impacto en el movimiento de los espermatozoides que la DGC sola. c/o: semen sin tratamiento, tratado: semen tratado con DNasa I, a: espermatozoides rápidamente progresivos, b: espermatozoides lentamente progresivos, c: no progresivos, d: inmóviles, y y PR: motilidad de (a+b).
Se evaluó el TPMSC poslavado en relación con el número inicial (rendimiento) de cada preparación (M&M). El rendimiento del tratamiento de gradiente de densidad en el caso de un individuo sin viscosidad del semen fue del 27,096% (Figura 5, w/o V-d). El rendimiento de la misma preparación en el caso de los individuos con alta viscosidad (Figura 5, HV-d) fue del 18,519%. El cambio en ambos casos con respecto a su respectivo control (es decir, Figura 5, w/o V, HV) fue estadísticamente significativo (p<0,0001 y p=0,0377, respectivamente, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple), lo que denota que se perdió una gran cantidad de espermatozoides PR tras el tratamiento con DGC. Cuando los espermatozoides de los individuos con alta viscosidad se sometieron al tratamiento con DNasa (Figura 5, HV-DNasa), el rendimiento correspondiente fue del 42,47%, mientras que la comparación entre el tratamiento de gradiente de densidad (HV-d) y el tratamiento con DNasa (HV-DNasa) dio como resultado una p<0,0001 con respecto al grupo HV, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple. A pesar de la magnitud del logro anterior, la combinación del tratamiento con DNasa seguido del tratamiento con gradiente de densidad (Figura 5, HV-DNasa-d) da como resultado un 29,782% (p=0,0121 con respecto al grupo HV, prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple). Además, la preparación combinada (HV-DNasa-d) se comparó con el % de espermatozoides PR en el semen de alta viscosidad antes de cualquier tratamiento (Figura 5, HV), y dio como resultado p=0,448, lo que significa que se recuperó la mayor parte de los espermatozoides PR. Además, en comparación con el grupo w/oV-d no hay diferencias estadísticamente significativas como p=0,619 en la prueba de Kruskal-Wallis de comparación múltiple.
Evaluación del % de rendimiento (TPMSC después del tratamiento/total de espermatozoides antes del tratamiento) de la DGC, del tratamiento con DNasa y de la combinación de ambos, en semen con viscosidad alta o normal. w/oV-d: semen con viscosidad normal después del DGC, HV-d: semen con alta viscosidad después del DGC, HV-DNase: semen con alta viscosidad después del tratamiento con DNasa, y HV-DNase-d: semen con alta viscosidad después del tratamiento con DNasa, seguido del DGC. w/oV: semen con viscosidad normal antes del tratamiento; HV: semen con alta viscosidad antes del tratamiento.
A continuación, la evaluación de la morfología de los espermatozoides tras una incubación de quince minutos con DNasa I da lugar a un aumento estadísticamente significativo del porcentaje de espermatozoides normales, que pasa del 5,468% al 7,25%, p=0,0197, como se ilustra en la figura 6. Al mismo tiempo, las anomalías de la cabeza disminuyeron del 81,75% al 74,937% (p=0,0004), mientras que las anomalías del cuello disminuyeron del 22,062% al 19,343% (p=0,0197). Las anomalías de la cola y la gota citoplasmática siguen el mismo patrón. Como resultado de estas alteraciones en la morfología, es razonable observar un impacto importante en el índice de teratozoospermia (TZI). Como se muestra en la Figura 6, disminuyó de 1,205 a 1,084 (p<0,0001).
La incubación de quince minutos con DNasa I racionaliza la morfología de los espermatozoides y el TZI del semen de alta viscosidad. w/o: semen sin tratamiento, tratado: semen tratado con DNasa I, abn de la cabeza: anomalías de la cabeza, abn de la cola: anomalías de la cola, y TZI: índice de teratozoospermia.
4. Discusión
En este estudio, planteamos la hipótesis de que la hiperviscosidad del semen tiene su origen en las NET. Los datos presentados muestran que la digestión del ADN extruido de las NETs es factible, lo que conduce a la mejora de la motilidad de los espermatozoides. Se examinó la digestión enzimática del ADN del plasma seminal con vistas a aumentar la motilidad de los espermatozoides, haciéndolos así aptos para su uso en las TRA. El uso de DNasa I tras la licuefacción de los espermatozoides dio lugar a una mejora tanto de la motilidad como de la morfología de los mismos. Se utilizaron varios puntos de tiempo de incubación para lograr los mejores resultados, que se obtuvieron tras 15 minutos de incubación. El objetivo del estudio era la mejora del rendimiento de la inseminación intrauterina, en la cohorte de hombres con subfertilidad, cuyos espermatozoides se caracterizan por una alta viscosidad, muy probablemente debido a los obstáculos causados por el ADN extruido. Además, el uso de DNasa I mejoró la morfología anormal que suele coexistir con la alta viscosidad. También se evaluó el enriquecimiento espermático según el número final de espermatozoides aislados, tanto de progresión rápida como lenta.
La mejora estadísticamente significativa de la morfología de los espermatozoides tras el tratamiento con DNasa I puede sugerir que estas anomalías se materializan tras la eyaculación y se mantienen debido a la alta viscosidad. Teniendo en cuenta que el semen hiperviscoso tiene una capacidad antioxidante total reducida, la presencia de espermatozoides en este entorno puede inducir la peroxidación lipídica y el daño del ADN y, finalmente, el deterioro de la morfología. Al menos algunas de estas anomalías morfológicas resultaron ser reversibles mediante el tratamiento con DNasa I. Esta mejora sugiere una aplicación óptima del tratamiento mencionado en los casos en los que no hay una demanda tan elevada de un gran número de espermatozoides directamente móviles, como en el caso de la inseminación intrauterina, pero en los que se exige la mejor morfología posible, como es el caso de la FIV o del procedimiento ICSI para la fecundación.
Nuestros resultados revelan que la aplicación de la DNasa I sólo es eficaz en presencia de hiperviscosidad. Como muestra la figura 2(b), en ausencia de hiperviscosidad, el uso de DNasa I no lo hace. En concreto, bajo una viscosidad normal e independientemente de la motilidad de los espermatozoides, la digestión enzimática no dio lugar a ninguna diferencia estadísticamente significativa en ninguno de los parámetros examinados. Por el contrario, en la cohorte de semen hiperviscoso, el uso de la enzima dio lugar a una mejora de la motilidad de los RP de forma estadísticamente significativa, como se muestra en la Figura 2(a). Además, no hubo diferencias en la motilidad de los espermatozoides ni en la recuperación de la morfología en el grupo de HV según la viscosidad severa o moderada, aunque el número de muestras de semen con viscosidad severa fue bajo. Además, como se muestra en la figura 5, la diferencia estadísticamente significativa tras la preparación de la DGC entre el grupo de alta viscosidad (HV-d) y el grupo de viscosidad normal (w/oV-d) es de 0,0179, lo que sugiere que se puede conseguir una mejora. Además, en la misma figura, el rendimiento del tratamiento combinado (HV-DNasa-d) dio lugar a la recuperación de un porcentaje de espermatozoides PR, que alcanzó el nivel de los espermatozoides correspondientes en los hombres con alta viscosidad (HV) antes del tratamiento, ya que el porcentaje final de PR (29,782%, HV-DNasa-d) en el primer caso no tiene ninguna diferencia estadística con el PR inicial (26,478%, HV antes del tratamiento), p=0,4480. La importancia de este enfoque combinado, aunque disminuye el rendimiento en comparación con el tratamiento con DNasa solo (p<0001 entre HV-d y HV-DNasa), se vio corroborada por el hecho de que el tratamiento de gradiente de densidad restó a los espermatozoides recuperados, (c) y (d) de clase, purificándolos. Por el contrario, la diferencia estadística correspondiente entre el rendimiento de la preparación de DGC (HV-d, 18,519%) y «HV antes del tratamiento» (26,478%) fue significativa (es decir, p=0,0322).
Además, podría reemplazar el tratamiento mecánico del semen hiperviscoso; así, comúnmente se diluye o se introduce en una aguja hipodérmica y se fuerza su paso para superar la elevada viscosidad. Aunque es poco probable que estos métodos sean eficaces porque este tipo de tratamiento aumenta la producción de ROS . Además, la hiperviscosidad se correlaciona negativamente con la integridad de la cromatina como descondensación defectuosa, lo que ya se ha observado .
En general, la aplicación de la DNasa I en el tracto respiratorio ya ha sido aprobada médicamente por la FDA en el caso de la fibrosis quística . Además, la DNasa es un componente natural del plasma seminal cuyo papel es probablemente la dilución de los NETs formados en la vía reproductiva femenina tras el reclutamiento de neutrófilos en respuesta a la inflamación, y el procedimiento propuesto es potencialmente aplicable médicamente en las TRA. Su papel también se ve reforzado por el hecho de que su ausencia tiene efectos adversos en la inseminación de los primates.
La hiperviscosidad es probablemente causada por la inflamación o por cualquier disfunción de las glándulas seminales, aunque el mecanismo exacto no está claro. Podría estar asociada a infecciones víricas del tracto genital, como ya demostró nuestro laboratorio. Se han aplicado varios protocolos terapéuticos para reducir la viscosidad del semen, pero rara vez los resultados han sido alentadores. Métodos como la sobrehidratación y el masaje prostático no han dado los resultados esperados. El uso de enzimas proteolíticas como la alfa-quimotripsina dio resultados esperanzadores, pero su uso no ha sido adoptado.
En otro estudio, se utilizó la DNasa I para disminuir la viscosidad, pero los resultados finales no fueron exitosos en este sentido. Los autores no estudiaron los parámetros cualitativos del esperma, es decir, la motilidad. Además, el tiempo de incubación fue mucho mayor (una hora) que el propuesto por nosotros (quince minutos), por lo que el impacto neutro sobre la viscosidad podría atribuirse posiblemente a la incubación prolongada de la enzima con el plasma del semen.
Por último, a pesar de los datos de que la hiperviscosidad del semen se ha correlacionado con la inflamación del tracto genital masculino, es decir, vesículas seminales, lo que ha llevado al uso de antibióticos y antioxidantes, estas formas de terapia podrían tratar esta condición sólo en los casos en que el factor principal era la inflamación. Por lo general, está causada por diferentes factores que actúan de forma sinérgica y, por lo tanto, no existe una terapia causal directa para la hiperviscosidad.
Al exponerse a los estímulos inflamatorios, los neutrófilos, la principal población de leucocitos en el semen, ejercen su función protectora a través de la inactivación de las bacterias mediante la fagocitosis y la posterior eliminación a través de la exposición a enzimas proteolíticas y ROS. Un segundo modo de acción por el que los neutrófilos pueden neutralizar los patógenos es a través de la producción de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) . Las NETs son redes fibrosas tridimensionales, formadas principalmente por cromatina, que pueden atrapar e inmovilizar microorganismos. Se ha demostrado que las NETs son sensibles a la degradación por DNasa pero no por proteasa . Como la formación de las NETs se basa en el ADN y se ha demostrado que la DNasa seminal digiere el ADN extruido y libera los espermatozoides enredados, planteamos la hipótesis de que el uso de la DNasa exógena podría resultar un tratamiento valioso en los casos de hiperviscosidad seminal causada principalmente por la presencia de ADN extracelular de neutrófilos expuestos.
Desde el punto de vista de la fisiopatología, el concepto que atribuye la hiperviscosidad a la inflamación está prácticamente establecido. Las reacciones inflamatorias abarcan la formación de NETs a partir de los neutrófilos para atrapar microorganismos. Es muy probable que los espermatozoides consuman mucha energía tratando de liberarse de las NETs y, en consecuencia, el estudio de su estado de oxidación y apoptosis es de gran importancia. Además, el «efecto trampa» que ya se ha descrito es una consecuencia de la prevención del movimiento de los espermatozoides debido a su enredo con las NETs.
En este estudio, intentamos lisar el ADN extracelular del plasma seminal, que es el principal componente de las NETs, con DNasa I con el fin de liberarlos de las NETs y recuperar los parámetros de calidad de los espermatozoides, es decir, la motilidad y la morfología. Además, como muestra la figura 1, existe una diferencia estadísticamente significativa entre la concentración de WBC y el grado de viscosidad. El tratamiento propuesto se limita a la fase postejaculatoria y no a la clínica. Además, se verificó la hipótesis inicial de que el aumento de la viscosidad de los espermatozoides era el resultado de la presencia de ADN en el semen, aunque se necesitan más estudios para confirmar esta hipótesis. Teniendo en cuenta que los neutrófilos reclutados forman NETs a los sitios inflamados, planteamos la hipótesis de que el ADN en el semen proviene de los neutrófilos. Aunque no presentamos una prueba directa que respalde esta hipótesis, consideramos que, según nuestros conocimientos, la principal fuente posible de ADN es la cromatina de los neutrófilos que se extruye bajo la inflamación.
5. Conclusiones
Los resultados de nuestro estudio apoyan la conclusión de que el tratamiento con DNasa I proporciona una mejora estadísticamente significativa en la motilidad y morfología de los espermatozoides. Mejora los parámetros espermáticos básicos para las TRA, es decir, la motilidad y la morfología, sólo en el caso del semen hiperviscoso. Además, nuestros hallazgos sugieren que una de las principales causas del SHV es la formación de NETs y, por lo tanto, proponemos el potencial terapéutico y la utilidad de este enfoque.
Disponibilidad de los datos
Los datos utilizados para respaldar los hallazgos de este estudio están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud.
Aprobación ética
Todos los procedimientos realizados en este estudio y en los que participaron seres humanos se ajustaron a las normas éticas de la Comisión de Bioética y Deontología de la Universidad Nacional Kapodistriana de Atenas, Facultad de Medicina, aprobadas en enero de 2014 (número de referencia: 1130).
Consentimiento
Todos los pacientes dieron su consentimiento informado antes de su participación en el estudio.
Conflictos de intereses
Todos los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Contribuciones de los autores
Angelos D. Gritzapis y Vassilis Tsilivakos concibieron el estudio. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis y Vassilis Tsilivakos realizaron la adquisición de datos, participaron en su diseño y redactaron el manuscrito. Effrosyni Nosi llevó a cabo los inmunoensayos y Angelos D. Gritzapis realizó el análisis estadístico. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti y Vassilis Tsilivakos participaron en el análisis y la interpretación de los datos. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por el Laboratorio de Diagnóstico Clínico, Locus Medicus S.A.