Caracterización matemática de la dinámica del AT

La dinámica del AT viene dictada por cómo se organizan espacial y temporalmente sus componentes en el promotor. Dado que el AT puede asumir muchos estados de configuración distintos y que la evolución del estado es esencialmente estocástica, implicando a numerosas moléculas e interacciones complejas, empleamos las teorías de la estadística y la probabilidad para investigar la dinámica del AT. Para simplificar, suponemos que las concentraciones de las especies asociadas a la transcripción, como los GTF, permanecen constantes alrededor del gen modelo y que las interacciones moleculares que implican al promotor están en equilibrio dinámico. El término «equilibrio dinámico» no significa que las interacciones moleculares sean todas reversibles, sino que sólo requiere que el AT recupere su estado actual después de algún tiempo. Un gen modelo y todas las especies que lo rodean constituyen un sistema. Los supuestos anteriores implican que dicho sistema se encuentra en un estado estacionario. Consideremos un conjunto estadístico formado por un gran número de estos sistemas esencialmente idénticos, cada uno de los cuales evoluciona de forma independiente. El número de sistemas es lo suficientemente grande como para que todos los posibles estados de configuración de la AT puedan ser cubiertos por este conjunto. Es decir, cada estado experimentado por un gen individual mapea los estados de otros genes en el conjunto y la proporción de genes en un estado especial X (por ejemplo, genes con sus potenciadores unidos por activadores), P(X), permanece constante a lo largo del tiempo. De forma equivalente, si se observa un gen individual en cualquier momento, la probabilidad de que el gen esté en el estado X es también P(X). En este sentido, el estado en el que se encuentra un gen individual es un evento aleatorio.

Para el modelo mínimo (Fig. 1a), definimos todos los estados de configuración del AT como un conjunto universal Ω y los diversos estados con las mismas características clave como los siguientes subconjuntos, respectivamente (Fig. 1b). A denota que el potenciador está unido a un activador. S denota que el núcleo del promotor está unido por las proteínas del SCF. M denota que un ARNm naciente está en gestación (incluyendo el proceso desde la formación del PIC hasta el escape de Pol II hacia la elongación). J denota que el activador unido al potenciador se conjuga con el SCF, el PIC o el OPC a través del Mediador. Dado que la iniciación transcripcional eucariótica requiere la presencia del SCF en el núcleo del promotor4,12, M⊂S. Según las definiciones, J⊂AS. En el conjunto MJ, M y A son concurrentes, es decir, los activadores unidos al potenciador pueden afectar directamente a la acción de Pol II a través del Mediador. Así, la iniciación transcripcional bajo regulación directa de los activadores es descrita por el conjunto MJ, mientras que la iniciación transcripcional basal, independiente de los activadores, se incluye en el conjunto M-J. La probabilidad de un ARNm naciente en la gestación, es decir, la probabilidad de que se genere un ARNm, es

donde q es una constante que representa la iniciación transcripcional basal y Aj es un subconjunto de A (ver S1 de la Información Suplementaria para más detalles). En Aj, los activadores unidos al potenciador están obligados a contactar con el mediador unido a SCF, PIC u OPC. La ecuación (1) caracteriza la relación entre la producción de ARNm y las propiedades dinámicas del AT.

Codificando la concentración de activadores transcripcionales

Obligando a distintas arquitecturas de la cromatina del promotor en diferentes etapas transcripcionales, los activadores unidos al potenciador pueden realizar varias funciones, como promover la acetilación de histonas y reclutar GTFs4,5,15. En concreto, el conjunto Aj implica a los activadores unidos al potenciador que se encargan de manejar la maquinaria transcripcional basal y de controlar la iniciación transcripcional. Además, las actividades de estos activadores también están asociadas a la codificación de la concentración nuclear de activadores, ya que es el único factor de la ecuación (1) que depende de la concentración de activadores. Aquí, investigamos la dinámica de dichos activadores.

Los activadores se mueven rápidamente dentro del núcleo y la probabilidad de que alcancen el potenciador es proporcional a su abundancia nuclear9. Consideremos un periodo de tiempo, durante el cual los activadores implicados en el conjunto Aj se unen y luego se alejan del potenciador durante m (m = 1, 2, 3, …) ciclos. Definimos la tasa de ocupación temporal RTOR de esos activadores como , donde y denotan el tiempo de unión y desunión del j-ésimo ciclo, respectivamente. Para el número fijo na de activadores en el núcleo, tenemos

donde aon y aoff son las funciones de propensión de unión y desunión, respectivamente (ver S2 de la Información Suplementaria para más detalles). aon es una función de na, mientras que aoff es independiente de na. La ecuación (2) indica que a medida que m aumenta, converge a un valor determinista, que es una función monotónicamente creciente de na (Fig. 1c-d y Fig. S1; esta es una propiedad general y puede aplicarse a los casos en los que el número de sitios de unión afines en el potenciador es mayor que uno (ver ecuaciones S13-S18)). Esta convergencia implica que incluso la concentración variable en el tiempo de los activadores puede ser codificada por RTOR, siempre que los activadores entren y salgan del potenciador con suficiente frecuencia a lo largo de una ventana de tiempo con su concentración casi inalterada. De hecho, existen mecanismos de disociación activos que garantizan el ciclo rápido de los activadores9,19,20,21,22. Se ha estimado que el tiempo de unión está en el rango de segundos a decenas de segundos9,10. Además, se demostró en el gen endógeno CUP1 que dicho ciclo rápido es funcional10. Presumiblemente, el RTOR codifica la concentración de activadores transcripcionales. Por otro lado, durante el periodo de tiempo en el que los activadores ciclan dentro y fuera del potenciador durante m veces, la probabilidad de que el potenciador se encuentre unido por dicho activador es . Dado que la media de sobre el conjunto es también f(na), tenemos

Las condiciones de restricción que aseguran respuestas transcripcionales fiables

Dada la estocasticidad en la ocurrencia de eventos transcripcionales, para lograr una respuesta transcripcional fiable se requiere que el código RTOR, que representa oportunamente la concentración de activadores, sea transducido con alta fidelidad en la cantidad de transcritos. Idealmente, si P(S), y fueran todos iguales a 1, se lograría la transducción exacta de la información. A continuación, presentamos las condiciones bajo las cuales esos tres factores pueden ser lo suficientemente grandes para asegurar respuestas transcripcionales fiables en presencia de fluctuaciones aleatorias (las Figs. S2 y S3 proporcionan explicaciones intuitivas para esta subsección).

La ecuación (3) implica que la concentración de activadores no puede ser suficientemente codificada sin la persistencia del SCF en el promotor. Así, el SCF debería ensamblarse rápidamente cuando la arquitectura de la cromatina lo permita y ser mucho más estable que los activadores unidos al potenciador (condición I). Esta estabilidad del SCF se ha observado experimentalmente y el tiempo de unión de la TBP (proteína de unión a la TATA, el componente central del SCF) al promotor puede ser de hasta 20 minutos en células humanas11. Para , Aj es una condición previa a la aparición de J. Dado que la RTOR está determinada por los cortos tiempos de unión individuales de los activadores, J debería ocurrir inmediatamente después de la aparición de Aj (Fig. S3). De lo contrario, la información sobre RTOR se pierde en gran medida o incluso se utiliza falsamente para dirigir la iniciación transcripcional (nótese que J es una precondición de M). Por lo tanto, para transferir correctamente el código RTOR, el Mediador debe actuar esperando a unirse a los activadores cíclicos y transmitir la información a través del alosterio23,24,25 (Condición II). Esto se debe a que otros tipos de interacciones moleculares como las colisiones libres no pueden transmitir con precisión la información sobre el tiempo de unión de los activadores. Tal alosterismo del Mediador es apoyado por el trabajo anterior26. determina cómo la información sobre RTOR heredada por J se convierte para guiar la cantidad de transcritos. Debido a que RTOR depende de la unión intermitente de los activadores, un gran requiere que durante los cortos periodos de unión, los transcritos se produzcan a un ritmo bastante rápido (Fig. S2) (Condición III). Esta característica también se verifica mediante estimaciones computacionales de los datos experimentales (ver S3 de la Información Suplementaria). Por lo tanto, las tres condiciones pueden satisfacerse de forma natural.

El mecanismo dinámico de la transcripción regulada por el activador

Las tres condiciones de restricción anteriores determinan conjuntamente el funcionamiento del AT. Surge repetidamente un estado en el que se forma un espacio relativamente estable de tipo pinza entre el mediador y el potenciador (Fig. 2; según las condiciones I y II). Como se ha demostrado experimentalmente que el SCF no es muy estable11 , este espacio se construye temporalmente. El espacio en forma de pinza atrae a los activadores libres y luego los despega rápidamente, con la RTOR decidida por la concentración de los activadores (según las ecuaciones (2-3)). Una vez que una molécula de activador entra en este espacio, surge el alosterio en el Mediador, resultando en una circunstancia facilitada para que los GTFs y otras proteínas relacionadas realicen sus funciones. En consecuencia, las Pol II pueden iniciar/reiniciar la transcripción muy rápidamente (según las condiciones II y III), siendo el RTOR el que gobierna la cantidad de transcritos.

Este mecanismo sugiere que las interacciones moleculares que implican al promotor obedecen a elegantes principios dinámicos como los siguientes. Mientras que el espacio en forma de pinza se forma temporalmente, es mucho más estable que los activadores asentados en él. Los activadores pueden entrar y salir del espacio muchas veces, incluso durante episodios breves en los que su concentración permanece casi inalterada; así, la concentración de activadores puede ser representada por RTOR oportunamente. Dado que el mediador transmite la información a través del alosterio y la tasa de reiniciación transcripcional es mucho mayor que la tasa de ciclado de los activadores, el código RTOR se emplea eficazmente para dirigir la síntesis de ARNm. En una palabra, el espacio en forma de pinza es la base estructural de las respuestas transcripcionales fiables. En lugar de ser un obstáculo, la naturaleza estocástica de las interacciones moleculares se utiliza plenamente para inducir la transcripción de forma fiable; esto depende en gran medida de los diferentes grados de estabilidad de los componentes del AT, que abarcan varios órdenes de magnitud. Los argumentos anteriores están respaldados por datos experimentales y las escalas de tiempo típicas son las siguientes: el tiempo de vida media del espacio tipo pinza es de unos 5 min11, el tiempo de ocupación de los activadores en el espacio está dentro del rango de segundos a decenas de segundos10, el alosterio suele ocurrir dentro del tiempo de milisegundos a no más de 1 segundo23,24,25 y sólo se necesitan varios segundos para reiniciar una transcripción (ver S3 de la Información Suplementaria).

Validación del mecanismo mediante simulaciones numéricas

Para verificar aún más el mecanismo dinámico propuesto, construimos un modelo estocástico simplificado de transcripción de genes con parámetros fisiológicamente realistas (véase la Fig. S4 y S4 de la Información complementaria para más detalles). Este modelo representa las transiciones de estado clave del AT y también describe de forma sencilla la dinámica de la cromatina relacionada, siendo así capaz de caracterizar la respuesta transcripcional a los activadores transcripcionales. A continuación, la «entrada» y la «salida» denotan la concentración nuclear de activadores y la cantidad de productos génicos, ARNm o proteínas, respectivamente.

Primero, exploramos la evolución temporal del número de ARNm celulares a niveles de entrada constantes (Fig. 3a). En particular, los ARNm se producen en forma de ráfaga, de acuerdo con la opinión predominante14,27,28,29,30,31,32. Para las entradas de bajo nivel, un alelo se transcribe mientras el otro es silencioso en una célula diploide y, por lo tanto, el fenómeno de estallido es evidente. Sin embargo, en el caso de las entradas de alto nivel, ambos alelos estallan con frecuencia, de modo que la suma se vuelve casi constante. Esto sugiere que el fenotipo de respuestas transcripcionales elevadas y persistentes puede observarse a niveles de entrada elevados14.

Un reciente análisis experimental descartó la posibilidad de que el entorno de la cromatina juegue un papel central en la conformación del estallido transcripcional32. Aquí, demostramos que una ráfaga de transcripciones se origina a partir de la reiniciación persistente por parte de las Pol II cuando el espacio tipo pinza está ocupado por los activadores (Fig. 4). Es decir, la iniciación del ARNm es en sí misma una explosión. El estallido no es mero ruido, sino que es una manifestación directa del código RTOR, que representa la concentración de activadores y guía la producción de ARNm.

En segundo lugar, investigamos la relación media de entrada/salida de la respuesta transcripcional. La salida media se asemeja a una función Hill de la entrada, que se utiliza ampliamente en la biología de sistemas para modelar la expresión génica3,33,34 (Fig. 3b). La curva de la desviación estándar SDout de la salida frente a la entrada tiene aproximadamente forma de campana (Fig. 3c). La intensidad del ruido intrínseco, definida como la relación entre SDout y la salida media35 , está inversamente correlacionada con la entrada (el recuadro de la Fig. 3b). Además, las características anteriores son insensibles a las ligeras fluctuaciones de la entrada (es decir, el ruido extrínseco) (Fig. S5), lo que sugiere la robustez de la respuesta transcripcional al ruido. Todos estos resultados están en buena concordancia con las mediciones experimentales tanto en Saccharomyces cerevisiae36 como en embriones de Drosophila37. En particular, el lado izquierdo de la curva SDout es más bajo que su lado derecho; esta característica coincide casi cuantitativamente con los datos experimentales37 (véase S5 de la información suplementaria para más información). Por el contrario, las desviaciones de los principios dinámicos propuestos anteriormente (incluyendo las circunstancias en las que el ciclo de los activadores es lento, el complejo de andamiaje/espacio de pinza no es estable, o/y la tasa de reiniciación transcripcional es baja) reducirían la capacidad del AT para responder de forma fiable a la entrada (Fig. S6).

La relación entrada/salida observada en los embriones de Drosophila se cree que se realiza utilizando al máximo el límite de las interacciones moleculares37,38,39. Las propiedades de tales interacciones microscópicas se integran para manifestarse macroscópicamente como SDout. La curva SDout sigue teniendo forma de campana en general en comparación con la curva SDin (cf. Fig. 1d). Es decir, la firma del código RTOR puede transmitirse directamente a la salida. Esto confirma que la tasa de ocupación temporal de los activadores es realmente explotada para regular la transcripción y el Mediador transmite la información a través del alosterio. Por otro lado, la curva SDout es asimétrica, siendo el lado derecho más alto que el izquierdo. La razón es obvia. Cuando la entrada es muy alta, el potenciador está ligado a los activadores casi todo el tiempo y, por tanto, las fluctuaciones reflejan principalmente las propiedades dinámicas del SCF y la reiniciación transcripcional por parte de las Pol II. Nuestras simulaciones posteriores muestran que el lado derecho de la curva SDout cae a medida que se incrementa la estabilidad del SCF o la tasa de reiniciación transcripcional; sólo cuando se incrementa su fuerza más allá de los rangos fisiológicos, la curva se vuelve simétrica (Fig. S6F). Esto también verifica que tanto P(S) como son efectivamente lo suficientemente grandes. Por lo tanto, las propiedades de SDout deberían probar de forma concluyente el mecanismo transcripcional microscópico.

En tercer lugar, sondeamos la distribución de los niveles de ARNm a través de una gran población celular expuesta a la misma entrada (Fig. 3d). Para entradas pequeñas, el fenómeno de estallido es especialmente obvio y la mayoría de las células no tienen mRNAs o tienen pocos. Esto es consistente con la observación experimental27,30,31. Pero la distribución se normaliza gradualmente a medida que aumenta la entrada. Para aon/aoff >1, la distribución se vuelve más aguda con el aumento de la entrada. Estos resultados esperan la identificación experimental.

En cuarto lugar, simulamos la respuesta transcripcional a una entrada que varía periódicamente. El proceso microscópico en un promotor es bastante dinámico y estocástico, con diferentes componentes del AT que exhiben distintas estabilidades (Fig. 3e). Sin embargo, la cantidad de ARNm puede seguir la entrada. Estos resultados están en buena concordancia con los resultados revelados por FRAP, es decir, el AT es un aparato altamente dinámico8,10,11,22. Por otro lado, las simulaciones de ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que caracterizan la evolución temporal de la distribución de los diferentes estados del promotor en una población celular, revelan una fuerte regularidad en las distribuciones (Fig. 3f). Los patrones tanto de los activadores que se unen al potenciador como de los SCF y Pol II que se unen al promotor siguen la entrada. Los transcritos de ARNm se producen en fase con la entrada, mientras que las histonas ocupan el promotor en fase inversa. Todos estos resultados coinciden con los hallazgos experimentales22,40. Por lo tanto, las discrepancias observadas entre los resultados de los experimentos FRAP y ChIP pueden tener su origen en las diferentes resoluciones implicadas en las mediciones. Las mediciones de ChIP integran las interacciones moleculares tanto temporalmente como sobre la población celular, mientras que FRAP refleja más estrechamente las interacciones instantáneas. Además, la respuesta transcripcional a la entrada variable en el tiempo es robusta al ruido extrínseco pero sensible a las señales de entrada compuestas y las desviaciones de los principios dinámicos (como los casos con baja tasa de ciclado de los activadores, el complejo inestable de andamios/espacio similar a una abrazadera, o/y la baja tasa de reiniciación transcripcional) reducirían la capacidad de respuesta (ver Figs. S7 y S8).