En los seres humanos, entran y salen aproximadamente de 5 a 8 litros de aire del pulmón por minuto en reposo. El aire puede variar en la concentración de oxígeno y CO2, puede llevar alérgenos y confiere diferentes grados de estiramiento mecánico de las vías respiratorias y las superficies de intercambio de gases. Estas señales se detectan, se transmiten y se procesan en salidas fisiológicas como el control de la presión sanguínea pulmonar, las respuestas inmunitarias y el ritmo respiratorio, pero el mecanismo no está claro. Las células neuroendocrinas pulmonares (PNEC) se encuentran en una amplia gama de organismos, desde peces hasta mamíferos (1). En el pulmón de los mamíferos, las PNEC son las únicas células epiteliales inervadas de las vías respiratorias y representan menos del 1% de la población total de células epiteliales del pulmón (2). Aunque las pruebas in vitro han implicado a las PNEC en la detección de oxígeno, el tono del músculo liso bronquial y vascular y las respuestas inmunitarias (1, 3), estas funciones no se han demostrado in vivo. Un estudio reciente demostró que la ablación genética de las CPNM en el adulto no comprometía la homeostasis ni la reparación de las vías respiratorias, lo que deja en entredicho la importancia in vivo de estas células (4). Se han documentado patologías de las CPNM, en particular un aumento del número de CPNM, en una gran variedad de enfermedades pulmonares, como el asma, la displasia broncopulmonar, la fibrosis quística, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la hernia diafragmática congénita, la hiperplasia neuroendocrina infantil, el síndrome de muerte súbita del lactante y la hipertensión pulmonar (5-8). En cada caso, no está claro si el aumento de PNEC es la causa o la consecuencia de los síntomas.

En el pulmón del ratón, la mayoría de las PNEC residen en grupos de ~3 a 20 células llamados cuerpos neuroepiteliales (NEB) (3, 9). Tanto las PNEC solitarias como las agrupadas contienen vesículas de núcleo denso, llenas de neuropéptidos bioactivos como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) o aminas como la serotonina (1). Estos se liberan en respuesta a estímulos, como los cambios en el nivel de oxígeno. Los neuropéptidos y las aminas se han implicado en algunos de los mismos procesos que las PNEC (10-12), lo que plantea la posibilidad de que puedan mediar en la función de las PNEC. Sin embargo, no se ha demostrado una relación causal in vivo.

Iniciamos el presente estudio para descubrir los mecanismos subyacentes a la hernia diafragmática congénita (HDC), un defecto de nacimiento asociado a una considerable disfunción pulmonar, que incluye una mayor respuesta inmunitaria e hipertensión pulmonar (13). En un modelo genético de ratón de HDC, descubrimos un defecto de agrupación fallida de PNEC. A esto le sigue una secuencia de acontecimientos: un aumento de los neuropéptidos de la PNEC, un aumento de los infiltrados inmunitarios y la remodelación de la estructura pulmonar. Estos hallazgos ofrecen una demostración in vivo de la función de las PNEC. Dado que los cambios en el número de PNEC y los neuropéptidos asociados se han documentado en muchas enfermedades pulmonares, nuestros resultados tienen amplias implicaciones más allá de la HDC.

En los seres humanos, las mutaciones en los genes de los receptores de rotonda (ROBO) se han asociado con la HDC (13, 14). Para estudiar los defectos pulmonares asociados a la HDC, inactivamos tanto Robo1 como Robo2 en el epitelio derivado del endodermo, incluyendo el pulmón, utilizando Shhcre (en adelante Shhcre;Robo mutante) en ratones (15, 16). Aunque estos mutantes sobreviven, presentan una superficie de intercambio de gases reducida a partir del día postnatal (P) 15 (Fig. 1, A y B, y fig. S1). Realizamos un microarray seguido de una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) en P7, antes de la reducción de la superficie de intercambio de gases. Quince de los 20 principales genes expresados diferencialmente han sido implicados en las respuestas inmunes, y todos están significativamente aumentados, incluyendo Ccl3, Cxcl2, Tnfa, y Saa3 (Fig. 1C). En consonancia con esta firma, observamos un número elevado de células inmunitarias, incluyendo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos y células T (Fig. 1, D y E, y fig. S2). Además, hay un aumento en la proporción de M2 y una disminución en la proporción de macrófagos M1 (fig. S3). Estos hallazgos indican que los mutantes Shhcre;Robo muestran una mayor sensibilidad inmunológica, imitando una comorbilidad común de la CDH (13).

Aunque Robo se expresa en la región alveolar del mesénquima pulmonar (fig. S4), su expresión en el epitelio está restringida a raras células a lo largo de la vía aérea (fig. 1F). El etiquetado con el anticuerpo CGRP reveló que las células epiteliales que expresan Robo son PNECs (Fig. 1G). Para confirmar que los genes Robo son necesarios dentro de las PNECs para su función, inactivamos Robo utilizando Ascl1creERT2 (17), un driver cre knock-in que confiere actividad específica a las PNECs en el epitelio pulmonar (fig. S5). Encontramos que los mutantes Ascl1creERT2;Robo mostraban tanto simplificación alveolar como aumento de macrófagos, recapitulando los fenotipos Shhcre;Robo (fig. S6). Estos hallazgos demuestran que Robo es necesario específicamente en las PNECs para restringir el número de células inmunes y prevenir la simplificación alveolar.

En el día embrionario (E) 13,5, las PNECs recién especificadas eran células solitarias tanto en los pulmones control como en los mutantes Shhcre;Robo (Fig. 2, A y B). Para el día E15.5, la mayoría de las PNECs se habían agrupado en NEBs en el control. Sin embargo, las PNECs no se agruparon en los mutantes Shhcre;Robo (Fig. 2, C y D). Este fenotipo altamente penetrante persistió en los pulmones postnatales (Fig. 2, E y F, y fig. S7). El número total de células PNEC parece no estar afectado, como lo apoya la expresión normal de Ascl1 y otros marcadores PNEC (fig. S8). Las células no agrupadas en el mutante pierden su forma de cuña y son más redondeadas (figs. S7 y S9). Además, en contraste con los controles, donde las PNEC solitarias no están inervadas (9), el ~33,3% (31 de 93 células) de las PNEC no agrupadas están inervadas en el mutante (Fig. 2F y fig. S9), sugiriendo que la inervación de las PNECs no depende de la formación de clusters o de la función de Robo en las PNECs.

Los mutantes Ascl1creERT2;Robo también exhiben PNEC no agrupadas (fig. S10). Este fenotipo se manifestó incluso cuando la inactivación de Robo fue inducida postnatalmente, lo que es posterior a la formación de los NEB. En conjunto, nuestros resultados establecen que Robo es necesario para el ensamblaje y mantenimiento de las PNEC en los NEBs.

Robo puede funcionar de forma dependiente o independiente de su ligando, Slit (18). El análisis de los mutantes de Slit muestra que, mientras que la agrupación de PNEC no se ve afectada en ninguno de los mutantes simples, se reduce en los mutantes Slit1;3 (fig. S11, A a D). Este resultado sugiere que la función de Robo en este proceso es probablemente dependiente del ligando.

Slit y Robo funcionan principalmente para mediar la repulsión celular y raramente la atracción (19). Para determinar si Slit actúa como señal de repulsión o atracción para las PNEC que expresan Robo, primero determinamos dónde se expresan los genes Slit. El reportero combinado Slit1;2-GFP (proteína verde fluorescente) reveló la expresión en sólo alrededor de 1 a 3 PNECs dentro de grandes NEBs, planteando la posibilidad de que las células que expresan Slit1/2 puedan ser las células nucleantes del grupo (fig. S11E). Esto también indica la subespecialización de las PNEC dentro de un cluster. La expresión de Slit3 está restringida a la capa de células lisas vasculares que rodean las arterias, que corre a lo largo de los bronquios principales donde se encuentran la mayoría de las PNEC (fig. S11, F y G). En conjunto, la proximidad de las células que expresan Slit a las PNEC que expresan Robo planteó la posibilidad de que los ligandos de Slit puedan proporcionar una señal atractiva para las PNEC.

Para probar esto, se sembraron PNEC GAD1-GFP+ clasificadas por citometría de flujo en la cámara superior de un inserto de cultivo de migración celular de Boyden. Cuando se añadió la proteína Slit con las células en la cámara superior, un ~52% menos (P = 8,5 × 10-4) de PNECs migraron a la parte inferior (fig. S12, J a I). Por el contrario, cuando se añadió la proteína Slit a la cámara inferior, un 18% más (P = 7,5 × 10-5) de PNECs migraron a la parte inferior (fig. S11, L a N). Estos resultados sugieren que Slit-Robo impulsa la agrupación de PNECs en los NEBs, probablemente a través de la atracción celular.

Para probar una posible relación entre las PNECs y la respuesta inmune, analizamos la expresión de neuropéptidos producidos por las PNECs (1). De los nueve genes de neuropéptidos analizados, cinco estaban significativamente regulados en los mutantes Shhcre;Robo (Fig. 3A). La tinción con un anticuerpo contra el CGRP reveló que, aunque su expresión permanece en las PNECs en el mutante, la intensidad de la tinción está aumentada y ya no está restringida a la cara basal de estas células (figs. S7 y S9). También observamos que, mientras que el desglose se produjo en E15.5, la regulación al alza de los neuropéptidos sólo se observa después del nacimiento, presumiblemente tras la exposición al aire (fig. S12).

Para determinar si el aumento de los neuropéptidos contribuye a la respuesta inmune, nos centramos en el CGRP porque su transcripción muestra el mayor aumento entre todos los ensayados (Fig. 3A). Contrarrestamos este aumento reproduciendo un alelo mutante de Cgrp en el fondo Shhcre;Robo (20). En los controles Robo, la pérdida de Cgrp no alteró el número de macrófagos (Fig. 3, B, D y F). Sin embargo, en los mutantes Shhcre;Robo, la pérdida de Cgrp disminuyó significativamente el número de macrófagos de forma dependiente de la dosis (Fig. 3, C, E y F). También descubrimos que la pérdida de Cgrp invertía parcialmente el fenotipo de simplificación alveolar (fig. S13). Observamos que ni el aumento de macrófagos ni la simplificación alveolar se impidieron por completo, lo que sugiere que el aumento de otros neuropéptidos puede contribuir a los resultados posteriores. En conjunto, estos resultados proporcionan una demostración genética in vivo de que los neuropéptidos median la función de la PNEC.

Como la alveologénesis normal se inicia en P4 (21), la aparición tardía de la simplificación alveolar en P15 sugiere que la interrupción de la alveologénesis puede no ser una causa primaria. Aunque no se observó ningún cambio en la muerte celular en P10, hubo una clara reducción de la elastina (fig. S14), que es un posible desencadenante de la simplificación (22). Las células inmunitarias, como los macrófagos, expresan metaloproteinasas de la matriz que degradan la elastina (23). Además, el aumento de macrófagos se observa antes de la simplificación (figs. S1 y S2), lo que plantea la posibilidad de una relación causal. Para comprobarlo, tratamos los pulmones de Shhcre;Robo y los de control con clodronato, un fármaco hidrófilo que agota los macrófagos (24). El tratamiento a partir de P5, antes del aumento de las células inmunitarias, restringió efectivamente el número de macrófagos alveolares al nivel de referencia en los mutantes Shhcre;Robo (Fig. 4, A a E). Esto atenuó la disminución de la elastina y evitó por completo la simplificación (Fig. 4, F a J, y fig. S15). En conjunto, estos datos ofrecen una demostración in vivo de que el aumento de los infiltrados inmunitarios es responsable de la simplificación alveolar y de que ambos son consecuencias posteriores de la disfunción de la PNEC.

En este estudio, presentamos pruebas genéticas in vivo que demuestran que las PNEC, a pesar de su rareza, tienen un profundo impacto en la función pulmonar postnatal. Aunque el defecto de las PNEC ya es evidente en E15.5 en el mutante Shhcre;Robo, los resultados fisiológicos, empezando por la regulación al alza de los neuropéptidos, se inician después del nacimiento. Esto sugiere que el efecto de la PNEC depende de la exposición pulmonar al aire. Así, nuestros hallazgos delinean un modo de transducción de señales en el que las PNEC son reóstatos sensibles en la pared de las vías respiratorias que traducen las señales ambientales de forma no celular-autónoma en respuestas inmunes.

Nuestros resultados establecen a Robo1,2 como un conjunto de genes que controlan la agrupación de PNEC en NEBs. También presenta a Slit y Robo como actores en la clasificación selectiva de células en el epitelio de un órgano de mamífero. La inactivación de Robo después de la formación de NEBs también condujo a la desclasificación, lo que sugiere que las agrupaciones se mantienen activamente. Aunque se sabe que Slit-Robo media en la repulsión celular, nuestros datos indican que impulsa la agrupación de PNEC a través de la atracción celular. La inactivación de Robo condujo a una inervación alterada y a la pérdida de la localización basal de los neuropéptidos. Estos cambios pueden subyacer al impacto alterado de las PNECs.

Se ha documentado un aumento del número de PNECs en una gran variedad de enfermedades asociadas al pulmón, que van desde trastornos raros como la CDH a condiciones comunes como el asma (5-8). Observamos que el fenotipo de la PNEC mutante de Robo es distinto del aumento del número de PNEC. Sin embargo, ambos están asociados a un aumento de los neuropéptidos, que demostramos que son potentes efectores de la función de las PNEC. Por lo tanto, nuestros hallazgos predicen que en lugar de ser una lectura pasiva de la enfermedad, las patologías documentadas de la PNEC y los aumentos de neuropéptidos pueden servir como contribuyentes activos a los síntomas en una gran variedad de enfermedades respiratorias.