Resultados y discusión

La caspasa-3 y la caspasa-7 muestran una actividad diferencial hacia sustratos sintéticos.

La caspasa-3 y la caspasa-7 se activan universalmente durante la apoptosis, independientemente del estímulo específico que inicie la muerte, y se considera que ambas proteasas coordinan la fase de demolición de la apoptosis escindiendo un conjunto diverso de sustratos proteicos (1, 2). Sin embargo, la contribución relativa de estas proteasas a la demolición celular sigue siendo en gran medida especulativa. La caspasa-3 y la caspasa-7 son las más relacionadas entre sí, en comparación con otras caspasas de mamíferos, pero no obstante muestran una divergencia de secuencia sustancial, con una identidad de secuencia global del 56% y una similitud de secuencia del 73% (Fig. 1A). Para explorar las preferencias de sustrato de estas caspasas con más detalle, expresamos ambas enzimas como proteínas marcadas con His en bacterias y las purificamos hasta su homogeneidad (Fig. 1B). Ambas caspasas fueron tituladas en el sitio activo contra DEVD-AFC en combinación con el inhibidor de policaspasas zVAD-fmk (Fig. 1C). Basándose en los datos de valoración del sitio activo, la concentración activa de cada enzima se normalizó para permitir comparaciones directas entre estas enzimas en experimentos posteriores (Fig. 1D). A continuación, comparamos estas caspasas en términos de su capacidad para hidrolizar un panel de sustratos tetrapéptidos sintéticos. Como ilustra la Fig. 1E, ambas caspasas escindieron preferentemente el DEVD-AFC con una eficiencia esencialmente idéntica. Por el contrario, la caspasa-3 escindió el LEHD-AFC más eficientemente que la caspasa-7, lo que sugiere que estas proteasas poseen actividades distintas hacia ciertos sustratos sintéticos (Fig. 1E).