Isozima tipo I

Como se desprende de la Fig. 1, la hexoquinasa sirve de puerta de entrada a través de la cual el Glc entra en las vías metabólicas alternativas. Sin embargo, es probablemente seguro decir que la hexoquinasa es más comúnmente considerada como una enzima glicolítica, y el metabolismo glicolítico es generalmente considerado un proceso citoplasmático. Por lo tanto, fue notable que, a diferencia de otras enzimas glucolíticas, la actividad de la hexoquinasa (que ahora se conoce como la isozima de tipo I) se encontrara predominantemente en «fracciones particuladas» de los homogeneizados cerebrales (Crane y Sols, 1953). Trabajos posteriores (Johnson, 1960; Rose y Warms, 1967; véase también Wilson, 1995) demostraron que la hexocinasa particulada estaba asociada a las mitocondrias y, más específicamente, a la membrana mitocondrial externa (Rose y Warms, 1967; Kropp y Wilson, 1970), 1992; Sui y Wilson, 1997) y se inserta en el núcleo hidrofóbico de la membrana mitocondrial externa durante la unión (Xie y Wilson, 1988). La porina (también llamada `VDAC’, acrónimo de `canal aniónico dependiente de la tensión’) forma el canal a través del cual los metabolitos atraviesan la membrana mitocondrial externa, y fue identificada como la proteína de la membrana mitocondrial externa que interactúa con la hexoquinasa (Felgner et al., 1979; Lindén et al., 1982; Fiek et al., 1982). Además, hay pruebas que apoyan la opinión de que la unión de la hexocinasa se produce preferentemente a la porina que se encuentra en los sitios de contacto, regiones en las que hay un contacto íntimo entre las membranas mitocondriales interna y externa (Dorbani et al., 1987;Kottke et al., 1988;BeltrandelRio y Wilson,1992a).

Los estudios clásicos de Johnson(1960) y de Rose y Warms(1967) fueron pronto seguidos por informes de hexocinasa unida a mitocondrias de otros tejidos normales, además del cerebro, así como de varias células tumorales (para referencias, véaseWilson, 1985,1995). La importancia fisiológica potencial de esta asociación de una enzima «glicolítica» con las mitocondrias, el lugar principal del metabolismo oxidativo, ha sido objeto de muchas especulaciones. Desde el principio, y sobre todo después de reconocer que la «proteína de unión a la hexocinasa» de la membrana mitocondrial externa era idéntica a la porina, y por tanto que la hexocinasa podría estar situada cerca del punto en el que el ATP saldría de la mitocondria (y el ADP volvería a entrar en ella), La especulación se centró en la posibilidad de que esta proximidad pudiera fomentar una interacción metabólica íntima entre la fosforilación oxidativa intramitocondrial como fuente de sustrato ATP y la fosforilación de Glc por parte de la hexoquinasa unida a la mitocondria. Esto había sido considerado por Rose y Warms (1967), pero no pudo ser apoyado por sus resultados experimentales. Sin embargo, el trabajo posterior de otros (de nuevo, para las referencias, véase Wilson, 1985, 1995), utilizando hexocinasa unida a la mitocondria de varias fuentes, produjo pruebas en apoyo de la opinión de que la hexocinasa unida a la mitocondria tenía un acceso «preferente» o «privilegiado» al ATP generado intramitocondrialmente.

El trabajo realizado en nuestro laboratorio ha proporcionado una base firme para la opinión de que la hexoquinasa unida a las mitocondrias cerebrales que fosforilan activamente está, de hecho, estrechamente acoplada a un compartimento intramitocondrial de sustrato ATP, generado por la fosforilación oxidativa. El apoyo experimental a esta conclusión se ha descrito en una serie de publicaciones (BeltrandelRio y Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar y Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto y Wilson, 2000). No es posible realizar una revisión completa de estos trabajos dentro de las limitaciones del presente contexto, pero destacaremos algunos de los principales resultados para ilustrar la variedad de enfoques experimentales, todos ellos conducentes a la misma conclusión, que se han utilizado en estos estudios.

Los estudios iniciales (BeltrandelRio y Wilson,1991,1992a,b)se realizaron utilizando métodos espectrofotométricos en los que la producción de ATP por varios procesos intramitocondriales (fosforilación oxidativa, reacción de adenilato quinasa, reacción de creatina quinasa) y la fosforilación de Glc por la hexoquinasa se vincularon a la producción de NADPH, monitorizada a 340 nm, mediante el uso de enzimas de acoplamiento adecuadas. La idea básica era que, comparando la tasa de fosforilación de Glc con la tasa de producción de ATP de varias fuentes, se podría deducir la importancia relativa de varios procesos intramitocondriales generadores de ATP como fuente de sustrato de ATP para la hexoquinasa. Y la conclusión fue que, cuando la fosforilación oxidativa estaba ocurriendo, ni la adenilato quinasa ni la creatina quinasa eran una fuente significativa de sustrato ATP. Además, sólo una fracción del ATP producido por la fosforilación oxidativa era utilizada por la hexoquinasa, con el resultado de que en el medio extramitocondrial seguía aumentando a medida que continuaba la fosforilación oxidativa. Sin embargo, la tasa de fosforilación de Glc no aumentó de forma constante en respuesta al aumento continuado de ATP extramitocondrial, a pesar de que este último era comparable a la Km de ATP observada con ATP extramitocondrial añadido en ausencia de fosforilación oxidativa, es decir, la hexoquinasa no se habría «saturado» con ATP extramitocondrial como sustrato (Fig. 2). Esto sugiere fuertemente que no era el ATP extramitocondrial el que se utilizaba como sustrato.

Por otra parte, los resultados como los que se muestran en laFig. 3 proporcionan apoyo a esto. Aquí, la glcfosforilación se monitorizó tras el inicio de la fosforilación oxidativa mediante la adición de ADP, con concentraciones crecientes de ATP extramitocondrial presentes desde el principio. Como se esperaba de la clásica Michaelis-Mentenkinetics, la tasa inicial de fosforilación de Glc aumentó con el aumento de la concentración extramitocondrial. Sin embargo, con el tiempo, se alcanzó una tasa de estado estable de fosforilación de Glc que era independiente de la cantidad de ATP extramitocondrial residual presente. Estos resultados se interpretaron como una indicación de que, si bien la hexoquinasa unida a la mitocondria utilizaba inicialmente el ATP extramitocondrial, la iniciación de la fosforilación oxidativa dio lugar a un cambio en la preferencia de sustrato, con lo que la hexoquinasa pasó a depender de un compartimento intramitocondrial de ATP en el que se determinaba el índice de fosforilación oxidativa y era independiente del extramitocondrial.

Aunque la producción de ATP comenzó casi inmediatamente después de la iniciación de la fosforilación oxidativa mediante la adición de ADP, hubo un marcado retraso en la iniciación de la fosforilación de Glc por la hexocinasa unida a la mitocondria (Fig. 3D) antes de alcanzar una tasa de estado estable que persistió durante un largo período. Este periodo inicial se interpretó como el tiempo necesario para llenar un compartimento intramitocondrial con ATP generado por la fosforilación oxidativa y del que la hexoquinasa unida a la mitocondria extrajo su sustrato ATP. La inhibición del transporte de electrones mediante la adición de KCN dio lugar a una aparente liberación de ATP, presumiblemente del compartimento intramitocondrial, y las propiedades de este «compartimento» (cinética de llenado, vinculación con la producción intramitocondrial de ATP, etc.Desgraciadamente, la concordancia con las expectativas no es una guía infalible de la realidad, y posteriormente se descubrió que la «aparente liberación de ATP» era un artefacto (Laterveer et al., 1993), cuya fuente sigue sin entenderse y que no pudo reproducirse en trabajos posteriores (deCerqueira Cesar y Wilson, 1998). A pesar de este desalentador y embarazoso contratiempo, el concepto básico de acoplamiento de la hexocinasa unida a la mitocondria con un compartimento intramitocondrial de ATP fue apoyado por otras evidencias y ha resistido las pruebas experimentales posteriores.

Se desarrolló un método de etiquetado isotópico doble como alternativa a los procedimientos espectrofotométricos (deCerqueira Cesar y Wilson, 1995). Se utilizó el Glc marcado con 14C como sustrato para la hexoquinasa y el 32Pi como sustrato para la síntesis de ATP por fosforilación oxidativa. La relación32P/14C en Glc-6-P proporcionó así una medida de la actividad específica del sustrato ATP utilizado por la hexoquinasa. La proporción32P/14C de Glc-6-P producida por la hexoquinasa unida a las mitocondrias se comparó con la producida por la hexoquinasa de levadura, que no se une a las mitocondrias y, por tanto, utiliza necesariamente ATP extramitocondrial como sustrato. La cinética de etiquetado de los grupos de ATP utilizados como sustrato por las hexocinasas unidas a las mitocondrias y a la levadura fue sorprendentemente diferente, de nuevo en consonancia con la opinión de que la hexocinasa unida a las mitocondrias no utilizaba ATP extramitocondrial como sustrato, sino que recurría a un compartimento intramitocondrial de ATP proporcionado por la fosforilación oxidativa.Por ejemplo (Fig. 4), la adición de un exceso de 31Pi, disminuyendo así notablemente la actividad específica del 32P-ATP sintetizado por la fosforilación oxidativa, dio lugar a una rápida disminución de la relación 32P/14C delGlc-6-P producido por la hexoquinasa de levadura, utilizando ATP extramitocondrial. Por el contrario, hubo un retraso y posteriormente una disminución algo más lenta en la relación 32P/14C de la Glc-6-P producida por la hexoquinasa unida a la mitocondria. Estas últimas observaciones fueron de nuevo consistentes con la opinión de que la hexoquinasa mitocondrial estaba utilizando un compartimento intramitocondrial de ATP que no estaba equilibrado libremente con el ATP extramitocondrial.

Otro enfoque experimental se basó en la comparación de la hexoquinasa unida a la mitocondria y la enzima de levadura no unida (de Cerqueira César y Wilson, 1998, 2002). La lógica subyacente se ilustra en la Fig. 5. Una cantidad fija de mitocondrias de cerebro, con hexocinasa unida, se mezcla con cantidades crecientes de mitocondrias de hígado de rata, que no contienen hexocinasa unida. Tanto las mitocondrias cerebrales como las hepáticas fosforilan activamente y, por lo tanto, hay una tasa creciente de producción de ATP en el sistema a medida que aumenta la cantidad de mitocondrias hepáticas. Por diseño, la concentración de ATP extramitocondrial se mantiene subsaturada, es decir, ÅKm de hexocinas con ATP extramitocondrial como sustrato (en ausencia de fosforilación oxidativa). Si la hexoquinasa unida a la mitocondria utiliza ATP extramitocondrial como sustrato, se espera un aumento progresivo de la tasa de glcfosforilación a medida que se incrementa la tasa de producción de ATP mediante la adición de cantidades crecientes de mitocondrias hepáticas. De hecho, esto no es lo que se observa; más bien, la tasa de fosforilación de Glc por la hexoquinasa unida a las mitocondrias no se ve afectada significativamente por el aumento de la tasa de producción de ATP (Fig. 6). Por el contrario, el aumento esperado en la tasa de fosforilación de Glc se observa si la hexoquinasa mitocondrial se sustituye por una cantidad equivalente de hexoquinasa de levadura. Estos resultados son, por lo tanto, de nuevo consistentes con la opinión de que la hexocinasa unida a la mitocondria está utilizando ATP intramitocondrial, intrínseco a las mitocondrias con las que la hexocinasa está asociada pero independiente de cualquier aumento de ATP inextramitocondrial que emane de las mitocondrias hepáticas libres de hexocinasa.

Por último, una prueba más de la opinión de que la hexoquinasa unida a la mitocondria puede discriminar entre el ATP intra y extramitocondrial proviene del examen de la inhibición por el análogo de Glc-6-P, 1,5-anhidroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). En ausencia de fosforilación oxidativa y con ATP extramitocondrial como sustrato, el 1,5-AnG6P es un inhibidor bastante potente, competitivo frente al ATP (Fig. 7) (Hashimoto y Wilson, 2000). En cambio, con el ATP suministrado por la fosforilación oxidativa, el 1,5-AnG6P es mucho menos eficaz como inhibidor. Claramente, el ATP suministrado por la fosforilación oxidativa no es equivalente al ATP extramitocondrial. Recientemente se han comunicado resultados similares utilizando la hexoquinasa mitocondrial del cerebro bovino (de Cerqueira y Wilson, 2002).

En resumen, la opinión actual es que, en ausencia de fosforilación oxidativa, la hexoquinasa mitocondrial puede utilizar fácilmente el ATP extramitocondrial, siguiendo la cinética clásica de Michaelis-Menten. Sin embargo, durante la fosforilación oxidativa activa, la enzima ligada a la mitocondria está acoplada a un pool intramitocondrial de ATP, y la tasa de Glcfosforilación está estrechamente correlacionada con la tasa de fosforilación oxidativa.Parece difícil creer que, en el tejido normal, las mitocondrias estén alguna vez en un estado de no fosforilación total. ¿Cambios en la tasa? Sí, por supuesto, dependiendo de las fluctuaciones en la demanda de energía. Pero, ¿realmente no fosforilante? Probablemente sólo en las circunstancias más extremas y, en última instancia, letales. Por lo tanto, se deduce que, en condiciones normales, la tasa de fosforilación del Glc está estrechamente coordinada con las etapas oxidativas terminales del metabolismo del Glc que tienen lugar en las mitocondrias, con la producción asociada de ATP por fosforilación oxidativa. Como se ha señalado anteriormente (BeltrandelRio y Wilson, 1992a), dicha coordinación puede asegurar la introducción de Glc en el metabolismo glicolítico a un ritmo acorde con las etapas oxidativas terminales, evitando la producción de lactato neurotóxico (Marie y Bralet, 1991) y asegurando al mismo tiempo el flujo neto a través de las porciones citoplásmica y mitocondrial de la vía a un ritmo adecuado para satisfacer las demandas de energía (Fig. 8).

No se sabe cómo este notable cambio en la especificidad del sustrato (ATP intramitocondrial frente a extramitocondrial) es inducido por la fosforilación oxidativa, pero está claro que la conformación de la enzima unida a la mitocondria se ve afectada por el potencial de la membrana mitocondrial, así como por otros factores relacionados con la función mitocondrial, lo que indica una interacción íntima entre las membranas interna (a través de la cual existe el potencial de membrana) y externa (a la que se une la hexoquinasa) de este orgánulo (Hashimoto y Wilson, 2000).Los cambios conformacionales que afectan a las regiones de la molécula implicadas en la unión del sustrato ATP se habían postulado previamente (de Cerquiera y Wilson, 1998) como responsables de los cambios en la especificidad del sustrato.