Investigación del perfil de seguridad de cuatro especies de Copaifera y del ácido kaurenoico mediante la prueba de Salmonella/Microsoma
Abstract
Los árboles del género Copaifera son nativos de las regiones tropicales de América Latina y África occidental. La Copaifera sp es ampliamente utilizada como medicina popular y tiene varias indicaciones etnofarmacológicas, entre ellas la gonorrea, la bronquitis, el asma, las úlceras de la piel, las úlceras, el dolor de garganta, las infecciones uterinas, las inflamaciones generales, el cáncer y las leishmaniosis. El ácido kaurenoico es un diterpeno natural que se encuentra en la Copaifera y se ha utilizado como antiinflamatorio, tratamiento de la úlcera, la leishmaniosis y el cáncer. Teniendo en cuenta que el test de Ames es una excelente herramienta para evaluar la seguridad de los extractos, aceites y fitoquímicos aislados de las plantas medicinales, a partir de él evaluamos el potencial mutagénico de cuatro especies, entre oleorresinas (C. oblongifolia; C. langsdorffii) y extractos de hojas (C. lucens; C. multijuga), del género Copaifera y también del ácido kaurenoico, que es uno de sus principales compuestos. Los resultados mostraron que la Copaifera spp. y el ácido kaurenoico no indujeron un aumento del número de colonias revertientes, sin efecto mutagénico en los experimentos, en todas las concentraciones evaluadas por la prueba de Ames. Los resultados obtenidos en nuestro estudio apoyan el uso seguro de las plantas medicinales del género Copaifera seleccionadas y del ácido kaurenoico.
1. Introducción
A lo largo de la historia, diferentes culturas han utilizado las plantas con fines medicinales. De hecho, las plantas han demostrado ser una fuente de medicamentos para el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades. Hoy en día, los sistemas basados en las plantas siguen desempeñando un papel esencial en la salud y el interés por los productos fitomedicinales ha aumentado en todo el mundo, hasta el punto de que las plantas siguen siendo investigadas como fuente de nuevos agentes medicinales.
Los árboles pertenecientes al género Copaifera son nativos de las regiones tropicales de América Latina y África occidental. El género Copaifera pertenece a la familia Leguminosae y comprende 72 especies. Existen más de 20 Copaifera spp. en el territorio brasileño, donde se les llama «copaibeiras», «pau d’óleo» o «copaíbas» . La Copaifera spp. se emplea ampliamente en la medicina popular. Tienen varias indicaciones etnofarmacológicas, como el tratamiento de la gonorrea, la bronquitis, el asma, las úlceras cutáneas, el dolor de garganta, las infecciones uterinas, las inflamaciones generales, el cáncer y las leishmaniasis .
La literatura científica contiene numerosos informes sobre las actividades farmacológicas de las especies de Copaifera, como sus acciones antiinflamatorias, antitumorales, antiproliferativas, antihelmínticas, antituberculosas, gastroprotectoras, quimiopreventivas, inmunomoduladoras y antibacterianas, entre otras.
El ácido caurenoico es un diterpeno que se encuentra naturalmente en algunas plantas brasileñas, incluyendo las oleorresinas de Copaifera. Se han descrito innumerables propiedades farmacológicas del ácido kaurenoico, como su efecto antiinflamatorio, su uso para tratar la úlcera y su potencial antiparasitario, analgésico y anticancerígeno.
Debido a que los compuestos naturales se han utilizado tradicionalmente, a menudo se supone que son seguros. Sin embargo, muchos estudios han informado de que varias especies de plantas aplicadas en la medicina tradicional presentan efectos mutagénicos, cancerígenos o tóxicos . No obstante, varias plantas y productos fitoterapéuticos siguen aplicándose sin pruebas científicas de su seguridad.
La prueba de Ames es mundialmente conocida por su capacidad para detectar mutaciones puntuales causadas por diferentes agentes. Esta prueba emplea cepas indicativas de Salmonella Typhimurium que son sensibles a sustancias que inducen distintos tipos de mutaciones. Sobre la base de la prueba de Ames, es posible establecer la acción mutagénica de un compuesto en función de la concentración de S. Typhimurium . Este ensayo se aplica para el cribado inicial del potencial mutagénico de nuevos fármacos en todo el mundo. La respuesta mutagénica tiene un alto valor predictivo de la carcinogenicidad. A lo largo de los años, la comunidad científica y las agencias gubernamentales y corporaciones han reconocido el valor de este ensayo.
Teniendo en cuenta que el ensayo de Ames es una excelente herramienta para evaluar la seguridad de extractos, aceites y fitoquímicos aislados de plantas medicinales, utilizamos este ensayo para evaluar el potencial mutagénico de las oleorresinas o extractos de hojas de cuatro especies de Copaifera y del ácido kaurenoico.
2. Materiales y Métodos
2.1. Material vegetal
El material vegetal fue recolectado en diferentes estados brasileños entre agosto de 2012 y mayo de 2014. Los vales de plantas fueron identificados por la Dra. Regina Celia Vianna Martins da Silva del laboratorio botánico de la Corporación Brasileña de Investigación Agrícola (Embrapa), Belém, Estado de Pará, Brasil, o por el Dr. Milton Groppo Junior del Departamento de Biología de la Universidad de São Paulo, Campus de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo, Brasil, donde se depositaron los vales. En la tabla 1 se indican las informaciones relativas a los especímenes voucher.
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1 SPFR: Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto, Departamento de Biología, Ribeirão Preto, São Paulo; 2 EMBRAPA: Corporación Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa Amazonia Oriental).
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Para extraer las oleorresinas de C. oblongifolia y C. langsdorffii, se utilizó una barrena para perforar un agujero con diámetro de aproximadamente una pulgada. El agujero se perforó en el centro del tronco del árbol, a un metro del suelo. La oleorresina se drenó en una botella ámbar mediante un tubo conectado a un filtro. Una vez recogida la oleorresina, se selló adecuadamente el agujero.
Las hojas de C. lucens y C. multijuga se secaron al aire a 40°C durante 48 h o se liofilizaron y se pulverizaron en una batidora. El polvo obtenido se sometió a maceración en etanol/agua 7:3 a temperatura ambiente durante 48 h. Tras la filtración, el disolvente se evaporó a menos de 40°C al vacío. Este procedimiento se repitió cuatro veces, y los extractos se combinaron, se concentraron al vacío y se liofilizaron, lo que proporcionó una media del 20% p/p de extractos hidroalcohólicos crudos de las hojas.
El ácido caurenoico (Figura 1), con una pureza superior al 99%, se aisló como detallan Simão et al. Las oleorresinas y las hojas de la especie Copaifera fueron recolectadas y la investigación se desarrolló tras la autorización del gobierno brasileño a través del SISBIO (Sistema de Información y Autorización de la Biodiversidad #35143-1) y del CGEN (Consejo de Gestión del Patrimonio Genético #010225/2014-5).
2.2. Prueba de Ames
Se utilizó la prueba de Ames para investigar la mutagenicidad de Copaifera spp. La metodología de preincubación desarrollada por Maron y Ames , con y sin activación exógena (S9), se empleó para analizar diferentes cepas de Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a y TA102) en un intento de identificar los agentes que causan mutaciones genéticas. Las cepas de prueba, amablemente proporcionadas por el Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, EE.UU.), se hicieron crecer a partir de cultivos congelados durante 12-14 h, toda la noche, en el caldo nutritivo Oxoid número 2.
Para el ensayo de actividad mutagénica, se añadieron varias concentraciones de cada oleorresina, cada extracto o ácido kaurenoico disuelto en DMSO a 0,1 mL de cultivo bacteriano en 0,5 mL de tampón fosfato 0,2 M o 0,5 mL de mezcla S9 al 4% y se incubaron a 37°C durante 20-30 min. Las concentraciones oscilaron entre 62,5 y 500 μg/placa para la C. lucens (extracto), entre 120 y 1000 μg/placa para la C. multijuga (extracto), entre 125 y 1000 μg/placa para la C. oblongifolia (oleorresina), entre 500 y 4000 μg/placa para la C. langsdorffii (oleorresina), y entre 25 y 200 μg/placa para el ácido kaurenoico. Estas concentraciones se seleccionaron sobre la base de un ensayo de toxicidad preliminar. En todos los ensayos posteriores, el límite superior del intervalo de dosis probado fue la dosis no tóxica más alta o la dosis tóxica más baja determinada en el ensayo preliminar. La toxicidad se detectó bien como una reducción del número de revertantes de histidina (His+) o como un adelgazamiento del césped de fondo auxotrófico.
La mezcla de activación metabólica (fracción S9) preparada a partir de los hígados de ratas Sprague Dawley tratadas con la mezcla de bifenilos policlorados Aroclor 1254 (500 mg/kg) se compró a Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, EE.UU.) y se preparó en fresco antes de cada ensayo. El sistema de activación metabólica consistió en un 4% de fracción S9, 1% de cloruro de magnesio 0,4 M, 1% de cloruro de potasio 1,65 M, 0,5% de D-glucosa-6-fosfato disódico 1 M, y 4% de sal sódica de nicotinamida adenina dinucleótido (NADP) 0.1 M en 50% de tampón fosfato 0,2 M y 39,5% de agua destilada estéril.
Después de la incubación, se añadieron 2 mL de agar superior, y la mezcla se vertió en una placa que contenía agar mínimo. Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h y se contaron manualmente las colonias revertantes His+.
Los resultados se analizaron con el paquete de software estadístico Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, del Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); se adoptó el modelo de Bernstein et al. Los datos (revertantes/placa) se evaluaron mediante un análisis de varianza (ANOVA), seguido de una regresión lineal. También se calculó el índice mutagénico (IM) para cada concentración ensayada, que correspondía al número medio de revertantes por placa de ensayo dividido por el número medio de revertantes por placa de control con disolvente. Una muestra se consideró mutagénica cuando se detectó una relación dosis-respuesta y el IM fue superior a dos (IM > 2) en una o más concentraciones.
Los siguientes mutágenos estándar se utilizaron como controles positivos en los experimentos sin mezcla S9: 4-nitro-O-fenilendiamina (10 μg/placa) para TA98 y TA97a, azida sódica (1,25 μg/placa) para TA100, y mitomicina C (0,5 μg/placa) para TA102. En los experimentos con activación de S9, se utilizó 2-antramina (1,25 μg/placa) como control positivo para TA98, TA97a y TA100, y 2-aminofluoreno (10 μg/placa) como control positivo para TA102. El DMSO sirvió como control de disolvente (100 μL/placa) y el control negativo corresponde a la tasa de reversión espontánea de cada cepa.
3. Resultados
La tabla 2 muestra el número medio de revertantes/placa (M), la desviación estándar (SD) y el índice mutagénico (MI) observados para las cepas de S. Typhimurium TA98, TA100, TA102 y TA97a en presencia (+S9) o en ausencia (-S9) de activación metabólica tras el tratamiento de la muestra con la oleorresina, el extracto o el compuesto objetivo.
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< 0.05 (ANOVA); < 0,01 (ANOVA); M ± SD = media y desviación estándar; Control negativo: tasa de reversión espontánea; Control de disolvente: dimetilsulfóxido (DMSO, 100 μL/placa); Control positivo (C+); una 4-nitro-o-fenilendiamina (10.0 μg/placa, TA98 y TA97a); b azida sódica (1,25 μg/placa, TA100); c mitomicina (0,5 μg/placa, TA102), en ausencia de S9; y d 2-antramina (1,25 μg/placa, TA98, TA100 y TA97a); e 2-aminofluoreno (10,0 μg/placa, TA102), en presencia de S9. Los valores entre paréntesis (MI) ≥2 indican mutagenicidad.
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Ni los extractos de hojas de C. lucens y C. multijuga ni las oleorresinas de C. langsdorffii y C. oblongifolia causaron mutaciones genéticas, como se puso de manifiesto en la prueba de Ames. El ácido kaurenoico tampoco aumentó el número de colonias revertidas, por lo que no ejerció efectos mutagénicos en ninguna de las concentraciones ensayadas ni en ninguna de las cepas evaluadas. El control del disolvente (DMSO) no difirió significativamente del número de revertantes con respecto al control negativo.
4. Discusión
Los efectos mutagénicos ejercidos por las plantas no son fácilmente perceptibles en los seres humanos, pudiendo manifestarse resultados adversos a largo plazo como el cáncer. Por ello, la literatura científica ha destacado la importancia de examinar las plantas medicinales para determinar su potencia mutagénica. En este sentido, aquí hemos examinado el potencial mutagénico de la Copaifera spp. y del ácido kaurenoico con la ayuda del test de Ames. Akyıl y Konuk destacaron que la detección de agentes genotóxicos suele basarse en el uso de bacterias como organismos de ensayo. De este modo, la prueba de Ames (o prueba de Salmonella/microsoma) es el método que más se utiliza para detectar los efectos mutagénicos de los agentes genotóxicos.
El rendimiento de la prueba de Ames utilizando diferentes cepas es de gran importancia teniendo en cuenta las peculiaridades de cada una de ellas en relación con la prueba. Así, el marcador hisG46 en la cepa TA100 resulta de la sustitución de una leucina (GAG/CTC) por una prolina (GGG/CCC). Esta mutación se revierte al estado salvaje mediante mutágenos que causan mutaciones de sustitución de pares de bases principalmente en uno de los pares de GC. La mutación hisD3052 que porta la cepa TA98 es una mutación de desplazamiento de cuadro -1 que afecta al marco de lectura de una secuencia repetitiva cercana -C-G-C-G-C-C-G-. La reversión de la mutación hisD3052 al estado salvaje es inducida por varios mutágenos de cambio de marco, como el 2-nitrofluoreno y varios derivados nitrosos aromáticos de carcinógenos amínicos. La mutación hisD6610 en la cepa TA97a también lleva una mutación de cambio de marco +1 (citosina) que da lugar a una serie de 6 citosinas (-C-C-C-C-C-). Se cree que esta cepa es más sensible a algunos de los mutágenos que revierten la cepa TA98. Se desarrolló la cepa TA102 que contiene pares de bases AT en el sitio mutante hisG428. La mutación se lleva en el plásmido multicopia pAQ1. El plásmido confiere resistencia a la tetraciclina, que es un marcador conveniente para detectar la presencia del plásmido. La mutación hisG428 es una mutación ocre, TAA, en el gen hisG que puede revertirse mediante los seis posibles cambios de pares de bases; tanto transiciones como transversiones. Esta mutación también es revertida por mutágenos que causan daño oxidativo, además de detectar agentes reticulantes.
Además, una sustancia química biológicamente activa puede ser biotransformada en un metabolito inactivo. Del mismo modo, una sustancia química inactiva puede ser biotransformada en un metabolito activo . Por lo tanto, es importante utilizar la fracción S9 en el ensayo de Ames: permite realizar análisis en presencia de metabolismo, proporcionando así resultados más fiables.
En lo que respecta a la seguridad, en nuestros resultados ni el ácido kaurenoico ni las plantas investigadas (extractos y oleorresinas) ejercieron efectos mutagénicos en las diferentes cepas de Salmonella Typhimurium, independientemente de la activación de S9.
La mayoría de los trabajos sobre el género Copaifera informan sobre oleorresinas extraídas del tronco del árbol. Sin embargo, el estudio de los extractos de las hojas también es relevante porque contienen moléculas bioactivas prometedoras. De hecho, la búsqueda de la cura de enfermedades a través de la infusión de las hojas puede haber sido una de las primeras formas de utilizar productos naturales, una práctica que se sigue adoptando en la actualidad.
Muchos Copaifera spp. se emplean popularmente como plantas medicinales en diferentes países porque estas especies presentan numerosas propiedades farmacológicas. En cuanto al ácido kaurenoico, también se ha informado de varios efectos biológicos.
Nuestro estudio es el primero en investigar sobre la seguridad de las especies C. lucens y C. oblongifolia y también en emplear C. langsdorffii en oleorresina para el estudio de la mutagenicidad. Los efectos de C. multijuga (oleorresina/extracto) sobre el ADN fueron abordados en estudios anteriores, sin embargo, empleando técnicas diferentes en relación con nuestro estudio que utilizó el test de Ames. Así, nuestros resultados corroboran con los datos publicados por otros autores, que probaron otras especies de Copaifera y sus constituyentes químicos, o utilizaron diferentes modelos experimentales, y demostraron que no dañan el ADN.
De este modo, la oleorresina de C. multijuga y su marcador químico, el ácido copálico diterpeno, fueron evaluados por Alves et al. mediante el ensayo de micronúcleos (célula V79) y el test de Ames para el estudio in vitro, así como los ensayos de micronúcleos y cometa (ratones suizos) para el ensayo in vivo. Los datos obtenidos mostraron que ninguno de ellos ejerce un efecto genotóxico/mutagénico en las condiciones experimentales empleadas. Al compararlos con nuestros resultados, estos datos indican que para C. multijuga tanto el extracto, evaluado en nuestro estudio, como la oleorresina, evaluada por Alves et al. , no afectan al número de colonias revertientes en comparación con el control negativo en la prueba de Ames; lo mismo ocurre con el ácido copálico y el ácido kaurenoico. Estos resultados sugieren que la mutagenicidad está ausente, independientemente de la activación metabólica.
En un estudio reciente Furtado et al. evaluaron el potencial genotóxico de C. multijuga y los resultados demostraron la ausencia de daños en el ADN, en vista de que el tratamiento tanto con la oleorresina como con el extracto de hoja de C. multijuga no aumenta significativamente la frecuencia de micronúcleos in vitro (célula V79) e in vivo (ratones suizos). Además, los autores también evaluaron extractos y oleorresinas de otras especies de este género, como C. duckei, C. reticulata, C. paupera y C. pubiflora y, al igual que los resultados encontrados para C. multijuga, se informó de la ausencia de genotoxicidad para todas las especies ensayadas.
Los resultados obtenidos en los estudios de Alves et al. y Batista et al. demostraron que el extracto de C. langsdorffii no aumentó significativamente la frecuencia de micronúcleos (ratones suizos) en sangre periférica y médula ósea, respectivamente. En otro estudio, el ensayo cometa con ratas Wistar no reveló diferencias significativas entre los animales tratados sólo con el extracto de C. langsdorffii y el grupo de control negativo. Estos datos muestran que el extracto no presenta genotoxicidad.
Recientemente, la prueba de micronúcleos in vivo y el ensayo cometa utilizando ratas Wistar mostraron que el extracto de Copaifera malmei no es genotóxico y tiene actividad antimutagénica. Además, la prueba de toxicidad subcrónica no reveló cambios toxicológicamente relevantes, a juzgar por los análisis conductuales, bioquímicos y hematológicos durante un máximo de 30 días. Estos resultados apuntan a que el extracto de Copaifera malmei tiene un alto margen de seguridad para su uso terapéutico. Las determinaciones de toxicidad y genotoxicidad evidenciaron que el uso del aceite de Copaiba también es seguro: la evaluación histopatológica no reveló cambios en los animales tratados con aceite de Copaiba, y la evaluación de la mutagenicidad (prueba de micronúcleos; 2000 mg/kg de peso corporal) no mostró efectos genotóxicos.
Leandro et al. utilizaron la prueba de Ames para demostrar que el extracto de C. trapezifolia no es mutagénico contra las mismas cepas de Salmonella Typhimurium probadas aquí, independientemente de la activación metabólica.
En relación con la composición química de las distintas especies de Copaifera, los análisis UPLC-MS/MS y CG/MS de las oleorresinas han identificado diterpenos ácidos y sesquiterpenos volátiles principales, mientras que en las hojas se ha verificado un alto contenido de compuestos fenólicos, incluyendo heterósidos flavonoides y derivados del ácido galloilquínico . Entre los constituyentes de la oleorresina, los diterpenos son, con mucho, los principales componentes e incluyen el ácido ent-agático, el ácido ent-copálico y el ácido ent-kaurenoico, seguidos de sesquiterpenos como el β-bisaboleno, el α-humuleno y el trans-β-cariofileno . En el caso de los extractos hidroalcohólicos de las hojas de la especie Copaifera, contienen principalmente quercetina, afzelina y ácidos quínicos.
Según Almeida et al. la oleorresina de Copaiba (producto comercial) y sus fracciones, que contienen sesquiterpenos, ésteres metílicos del ácido carboxílico diterpénico y niveles elevados de β-cariofileno, no son genotóxicos, como lo demuestra el ensayo cometa in vivo o la prueba de micronúcleos. El β-cariofileno, principal constituyente de las oleorresinas y de las fracciones volátiles, no promueve efectos citotóxicos o genotóxicos en los cultivos de linfocitos humanos, y protege contra el daño del ADN inducido por el sulfonato de etilmetano . La evaluación de nueve sesquiterpenos, incluido el transcariofileno, mediante la prueba de Ames ha demostrado que ninguno de los compuestos es mutagénico.
En un estudio reciente, el tratamiento de líneas celulares de cáncer gástrico y de mucosa estomacal normal con ácido kaurenoico demostró que la concentración del ácido está fuertemente correlacionada con el índice de daño en el ADN y con la frecuencia de micronúcleos, determinados por el ensayo cometa y la prueba de micronúcleos, respectivamente . Por otra parte, Cavalcanti et al. informaron de que bajas concentraciones de ácido kaurenoico, un diterpenoide bioactivo extraído de C. langsdorffii, tampoco ejercen daños en el ADN ni alteran la frecuencia de micronúcleos en las células V79. El aumento significativo del daño en el ADN se hizo evidente sólo después de la exposición de las células a concentraciones más altas de ácido kaurenoico (30 o 60 μg/mL).
Aquí, determinamos la toxicidad del ácido kaurenoico para cada cepa de Salmonella Typhimurium evaluada utilizando concentraciones de ácido a partir del límite de toxicidad. Las mayores concentraciones de ácido kaurenoico impiden el crecimiento bacteriano, lo que nos permitió evaluar el potencial mutagénico de este compuesto. Sobre la base de nuestros resultados, las oleorresinas aquí ensayadas no son mutagénicas ni siquiera a las concentraciones más altas ensayadas.
Según la bibliografía, el uso de diferentes organismos o diversos sistemas de ensayo puede proporcionar resultados distintos. Esto se debe a que los sistemas de prueba de genotoxicidad y mutagenicidad se dividen en dos grupos. Los métodos citogenéticos analizan a los eucariotas y dan información que varía desde la mutación de genes hasta el daño cromosómico y las aneuploidías. Por el contrario, los métodos bacterianos analizan procariotas y ofrecen información sobre la mutación de genes y el daño primario del ADN causado por un agente.
Así, se han aplicado pruebas como el intercambio de cromátidas hermanas, la aberración cromosómica y el micronúcleo para detectar el daño del ADN a nivel cromosómico en la biovigilancia humana, mientras que el ensayo de mutagenicidad Ames Salmonella/microsoma se ha empleado ampliamente para verificar la actividad mutagénica de innumerables sustancias químicas y extractos crudos de plantas.
Según Ferguson , las sustancias pueden ser clastogénicas en el caso de las células de mamíferos, que es el caso de las sustancias utilizadas en el ensayo de micronúcleos. Sin embargo, estas mismas sustancias pueden resultar negativas en ensayos bacterianos como el de Ames. Por lo tanto, es importante evaluar la seguridad de las plantas o de sus compuestos químicos centrándose en la evaluación de los diferentes tipos de daños genéticos. La asociación de la prueba de Ames con los estudios in vitro en células de mamíferos se recomienda porque pueden cubrir varios parámetros mutagénicos esenciales (mutaciones genéticas, daños estructurales en los cromosomas y aneuploidía) y también cubren las pruebas en sistemas procariotas y eucariotas. Además, la bibliografía también destaca que no debe omitirse el estudio mediante la prueba de Ames porque la prueba de mutación genética bacteriana detecta todos los modos de acción relevantes que conducen específicamente a mutaciones genéticas.
Trabajos anteriores observaron que los compuestos pueden ser exclusivamente positivos en una o más de las líneas celulares de mamíferos, es decir, los resultados positivos no se apoyaban en la prueba de Ames o en las pruebas in vivo . De hecho, los resultados obtenidos en primer lugar por el test de Ames se reproducen posteriormente en los ensayos con animales ; por lo tanto, la ausencia de mutagenicidad en el test de Ames ha permitido producir nuevos fármacos con menos efectos secundarios . Estos datos ponen de manifiesto la importancia de estudios como el nuestro, que demuestran la ausencia de mutagenicidad de las plantas y sus principales componentes, utilizando el test de Ames.
5. Conclusiones
En general, nuestros resultados apoyan el uso seguro de las plantas medicinales seleccionadas pertenecientes al género Copaifera. No obstante, los efectos mutagénicos de los compuestos individuales podrían quedar enmascarados debido a los efectos antagónicos de otros compuestos presentes en los extractos u oleorresinas . Por lo tanto, nuestros hallazgos también demuestran que tanto el ácido kaurenoico como las plantas medicinales evaluadas pueden considerarse potencialmente seguros para su uso terapéutico.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen dentro del artículo.
Divulgación
Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende y Jaqueline Lopes Damasceno tuvieron pleno acceso a todos los datos del estudio y asumen la responsabilidad de la integridad de los datos y la exactitud del análisis de los mismos.
Conflictos de intereses
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Contribuciones de los autores
Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani y Jairo Kenupp Bastos contribuyeron sustancialmente a la concepción y diseño, adquisición, análisis e interpretación de los datos. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende y Carlos Henrique Gomes Martins han participado en la redacción del manuscrito o lo han revisado críticamente por su importante contenido intelectual. Carlos Henrique Gomes Martins y Flávia Aparecida Resende aceptaron ser responsables de todos los aspectos del trabajo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la CAPES (Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior), al CNPq (Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico) y a la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, Becas nº 2011/13630-7 y 2012/25237-0) por el apoyo financiero y a la Universidad de Franca por el apoyo recibido. Jaqueline Lopes Damasceno fue beneficiaria de una beca de doctorado de la CAPES (Coordinación para la Mejora de la Educación Superior-Personal).