Dirección de genes en células madre embrionarias

A través del proceso de dirección de genes en células madre embrionarias, puede introducirse en la línea germinal de los ratones cualquier manipulación genética deseada. Se pueden eliminar secuencias genéticas específicas de forma constitutiva o condicional (Knock-out), se pueden realizar mutaciones específicas o alteraciones de pares de bases de forma precisa dentro de un gen de interés y se pueden introducir genes reporteros u otros casetes de expresión en lugares definidos dentro del genoma (Knock-in). Las secuencias murinas pueden cambiarse por secuencias humanas utilizando esta tecnología para generar modelos de ratón humanizados.

Esta técnica puede llevar hasta un año de desarrollo, por lo que es esencial invertir un tiempo considerable al principio del proyecto para garantizar que se seleccionan la tecnología y la estrategia genética más adecuadas para el modelo requerido. El núcleo transgénico puede ofrecer asesoramiento para este tipo de decisiones y es esencial que todos los proyectos de focalización se discutan en detalle con el núcleo antes de empezar a trabajar en el laboratorio.

Cuando se ha decidido una estrategia, se construye un vector de focalización y se diseña y prueba una estrategia de cribado robusta para garantizar que la manipulación genómica requerida pueda detectarse a nivel genómico. A continuación, el vector de orientación se transfecta en células ES y se examinan los clones recombinantes para detectar el evento de recombinación homóloga deseado. A continuación, estas células se inyectan en embriones de preimplantación y los ratones quiméricos resultantes se utilizan para la cría de la línea de ratones modificados genéticamente.

Servicio

Se ofrece un servicio flexible que puede desglosarse en las etapas específicas del desarrollo del modelo, en función de los recursos disponibles.

Inicio del proyecto – Gratuito

• Consulta con el grupo para abordar una tecnología apropiada para conseguir un modelo seguro y utilizable
• Control de los bancos de datos de trampas genéticas en busca de clones de células ES preexistentes
• Control de los recursos del consorcio Knock-out en busca de vectores de orientación preexistentes, clones y modelos de células ES

Consulta para la construcción de vectores de focalización – Gratuita

• Análisis de la secuencia genómica para identificar las regiones que tienen una alta probabilidad de ser regiones homológicas utilizables para la focalización de genes
• Consulta con el grupo para abordar la estrategia genética necesaria para lograr un utilizable
• La construcción del vector de focalización no es proporcionada por el núcleo pero el núcleo puede ayudar con la provisión de casetes y asesoramiento metodológico
• El establecimiento de la estrategia de cribado no es proporcionado por el núcleo pero el núcleo puede ayudar con la provisión de casetes y asesoramiento metodológico asesoramiento

Dirección de genes en células madre embrionarias

• Transfección del vector de dirección completado en células madre embrionarias
• Aislamiento y almacenamiento de al menos 192 clones celulares recombinantes independientes
• Preparación del ADN y entrega de placas de 96 pocillos para el cribado
• Congelación, expansión de clones putativos positivos
• Preparación de ADN adicional a partir de clones putativos positivos para el cribado de confirmación
• Análisis del cariotipo de los clones seleccionados

Inyección de blastocitos de clones de células ES

• Inyección de células ES en la inyección de embriones de preimplantación
• Generación y alojamiento de quimeras durante un máximo de 3 semanas.
• Recomendaciones para la estrategia de cría