Resultados y discusión

Se han investigado las estructuras y energías de varios sistemas modelo mutados de KSI a lo largo de tres pasos de reacción: primero, abstracción del protón C4-β (ES → TS1 → EI1); segundo, ligera rotación del Asp-40 protonado (EI1 → TS2 → EI2); y tercero, donación de protones a la posición C6-β por el Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), como se muestra en la Fig. 1. El perfil energético predicho de WT (Fig. 2A) es similar al experimental correspondiente de Pollack y colaboradores (25). Cabe destacar que en TS2 el sustrato está parcialmente neutralizado ya que los átomos de H de los residuos catalíticos se acercan al oxianión (O3) del sustrato y el exceso de electrones se transfiere del sustrato a los residuos catalíticos adyacentes a través de las vías de enlace de H. Así, el sustrato, Tyr-16/57, y Asp-103 comparten una unidad de carga negativa, y sus distribuciones de carga dependen de las afinidades de protones y afinidades de electrones de los residuos catalíticos de los mutantes. Este estado TS2 con residuos catalíticos se contrasta con el estado sin residuos catalíticos en el que el sustrato tiene una carga negativa de casi una unidad.

Nuestras estructuras tridimensionales calculadas de EIs (complejado con equilenina en lugar de esteroide) coinciden casi exactamente con las estructuras de rayos X de PI(g′) y TI(g′). En la estructura predicha del complejo Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenina, las dos distancias de los valores d(O3-Or) para Tyr-16 y Asp-103 (2,54 y 2,55 Å, respectivamente) están en buen acuerdo con los datos de rayos X (2,6 ± 0,1 Å para ambos en el caso de PI y 2,58 ± 0,08 Å y 2,62 ± 0,07 Å, respectivamente, en el caso de TI) (32, 33, 36). Dado que las estructuras calculadas se optimizaron sin restricciones, la coincidencia en las geometrías experimentales y teóricas indica que en la enzima los residuos clave tienen interacciones casi máximas con el sustrato sin tensión.

Se ha conjeturado que en solución el sitio activo de TI puede tener la estructura diádica (Asp-99… Tyr-14… equilenina) (29), que es diferente de las estructuras de rayos X de TI y PI (32, 33). Sin embargo, un reciente experimento de RMN para PI/equilenina ha indicado que, en PI(D40N)/equilenina, aparece una fuerte resonancia característica de campo descendente a 16,8 ppm, y una débil a 13,1 ppm (36), similar al caso de TI/equilenina por los grupos de Mildvan (29) y Pollack (25). Este resultado también queda demostrado por nuestros cálculos ab initio del complejo Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenina, en el que la fuerte resonancia de campo descendente a 16,5 ppm se asigna a Tyr-16. El experimento también muestra que, en el mutante D103L + D40N, aparece una fuerte resonancia de campo descendente (asignada a Tyr-16), mientras que en el mutante Y16F + D40N la fuerte resonancia desaparece. Por lo tanto, este experimento excluye claramente la estructura diádica en la que la fuerte resonancia de campo descendente se asignó a Asp-103, que está unido por H a Tyr-16 (36).

Las constantes de velocidad absolutas pueden investigarse utilizando las barreras de activación calculadas. En los niveles B3LYP/6-31+G* y MP2/6-31+G*, la barrera de activación del WT de KSI está algo subestimada, en comparación con la barrera experimental (10 a ≈11 kcal/mol) informada por Pollack y colaboradores (46). Sin embargo, cuando se tiene en cuenta el efecto del medio dieléctrico del KSI (31), la barrera de activación del WT es de 8,2 kcal/mol, lo que coincide con el valor experimental. Una ligera subestimación de 2-3 kcal/mol podría explicarse con un cálculo más preciso y un sistema modelo más completo que incluya residuos apolares alrededor del sitio activo. En contraste con la barrera de activación absoluta, las barreras de activación relativas entre diferentes mutantes y, por tanto, el mecanismo de reacción son bastante consistentes independientemente del nivel de cálculo debido al efecto de cancelación entre diferentes sistemas modelo que tienen entornos similares. Así, utilizando las barreras de activación relativas entre diferentes mutantes, obtuvimos la reactividad relativa (la relación entre la constante de velocidad cinética de un mutante y la del WT) o log(kcat/kcat(WT)) con la suposición de que la transferencia de ES a TS1 es el paso que determina la velocidad a lo largo de las rutas de reacción (véase la nota a pie de página de la Tabla 1). Los cálculos MP2 refuerzan los resultados obtenidos en el nivel B3LYP. Los valores predichos de log(kcat/kcat(WT)) están en buen acuerdo con los valores medidos para PI (32-35) y TI (25-28, 31) (Tabla 1). Dado que la estructura tridimensional (terciaria y cuaternaria) altamente homóloga y el entorno del sitio activo de TI son similares a los de PI, se espera que las reacciones catalíticas en las dos KSI procedan de la misma manera.

La Fig. 2 muestra los perfiles de energías y distancias de enlaces H para varios mutantes a lo largo de la ruta de reacción. Los perfiles energéticos globales (ΔE) (Fig. 2A) son casi simétricos con respecto a TS2. Las barreras del primer y tercer paso son similares. El segundo paso, que tiene una barrera pequeña (≈1 kcal/mol), no puede ser determinante para la tasa porque implica sólo un ligero desplazamiento del átomo de H a través de una rotación mínima (de sólo varios grados porque Asp-40 está muy inclinado contra el plano del sustrato) sobre un enlace C-C (o enlace C-H en las Figs. 1 y 3). Así, la reacción puede considerarse prácticamente como un mecanismo de dos pasos. Los residuos catalizan el primer paso donando (parcialmente) un protón al sustrato (como un ácido), mientras que el tercer paso es catalizado por la aceptación (parcial) de un protón del sustrato (como una base). Refiérase a las distancias interoxigenadas de los enlaces H y a la distancia descentrada de un protón compartido desde el punto medio de O3 y Or donde el valor positivo/negativo indica que el protón está cerca de los residuos/sustrato.

Para los residuos ácidos con menor afinidad protónica (pA en la fase gaseosa o pKa en el medio dieléctrico), la barrera de activación sería menor para el primer paso y mayor para el tercero, mientras que los residuos básicos con mayor pA o pKa producirían un efecto contrario. En consecuencia, en el mecanismo enzimático de dos pasos la potencia catalítica óptima se obtiene cuando los residuos de la enzima desempeñan un doble papel de donante/aceptor de protones muy fuerte hacia/desde el sustrato alternativamente (que se denominará catalizador anfibio/base o tampón de protones/electrones) para la reacción global. En el medio dieléctrico de las enzimas, el efecto catalítico máximo se obtiene en el caso de pKas iguales de los residuos y del sustrato . Esta situación contrasta con las reacciones de un solo paso en las que una gran diferencia de pKa aumenta la reactividad (47, 48). La condición de igualdad de pKas entre los residuos y el sustrato para el máximo efecto catalítico coincide con el requisito de que los residuos en la enzima posean pKas equivalentes con el sustrato para formar los máximos SSHB (4-7, 15, 23, 24). Por lo tanto, en el mecanismo de reacción de dos pasos de KSI, los SSHBs como catalizadores anfibio/base junto con lanzaderas parciales de protones y redistribuciones de carga juegan un papel crucial en la fuerte estabilización de EIs por ≈15 kcal/mol en la energía de estabilización impulsada por el residuo y en el acortamiento de la distancia interoxígeno dependiente de la ruta de reacción en relación con el estado ES .

La energía de estabilización impulsada por el residuo ΔΔEa está hasta cierto punto correlacionada con la ΔdES a menos que la transferencia de protones ocurra desde el residuo al sustrato (es decir, a menos que el ΔrH esté en una región negativa en la Fig. 2C). Por lo tanto, la estabilización en EIs y TSs puede correlacionarse con el acortamiento de la distancia del enlace H, y por lo tanto la fuerza del enlace H, en relación con el estado ES. Es decir, los enlaces H normales (u ordinarios) (entre compañeros neutros) en ES tienden a convertirse en SSHB (con participación de especies iónicas) en EIs y TS2. Por lo tanto, estos enlaces cortos deberían ser responsables de una parte de la disminución de energía impulsada por los residuos. En cuanto a la transferencia de protones, el potencial en ES es un pozo simple para todos los mutantes, mientras que la forma del potencial (cerca de EIs o TSs) en la región donde ΔrH está cerca de cero (es decir, alrededor de TS1/EI1 para c y EI1/TS2 para e y f en la Fig. 2C) tiene algunas características de un pozo doble. Para un valor absoluto pequeño de ΔrH (<≈0,5 Å) (Fig. 2C), la barrera para la transferencia de protones resulta ser muy pequeña en nuestro cálculo, por lo que las transferencias de protones en el potencial de tipo doble pozo no pueden explicar por sí solas la drástica disminución de la barrera de activación. De hecho, el caso g, en el que las características de doble pozo del potencial casi desaparecen con poca transferencia de protones, muestra una mayor disminución de la energía que el caso f, que implica la transferencia de protones en un potencial de doble pozo. Por otro lado, cabe destacar en la Fig. 2 D y E que, después de que se produzcan las transferencias de protones, el ΔdES ya no se acorta sino que se alarga ligeramente, mientras que el ΔΔEa sigue disminuyendo. Por lo tanto, el acortamiento de la longitud del enlace H por sí solo (es decir, el ΔdES) no puede explicar la drástica reducción de la barrera en los TS y los EI (es decir, el ΔΔEa). Por lo tanto, la disminución de la barrera en TSs y EIs debe explicarse por fuerzas de interacción adicionales, que se discutirán en términos de interacciones de orbitales moleculares (MO) entre sustratos y residuos (que implican reordenamientos electrónicos inducidos por transferencia de carga o redistribuciones de carga).

En el caso de dos residuos competidores como en f y g, la estabilización acumulativa de EIs/TSs resulta en un kcat más mejorado. Sin embargo, este efecto es algo subaditivo (es decir, menor que la suma de las energías de estabilización de cada residuo) como resultado de la reducción del poder de extracción de protones del oxianión para cada residuo debido a la presencia del otro residuo. Esta subaditividad indica que los SSHB implicarían transferencias de carga y polarización (es decir, interacciones electrostáticas inducidas) y posiblemente enlaces covalentes parciales. De hecho, la estabilización de EIs y TSs en presencia de residuos catalíticos surge principalmente de la deslocalización del exceso de electrones presentes en el sitio activo por transferencia de carga y polarización, lo que se verá más adelante. Las cargas efectivas de la población de orbitales de enlace natural (49) del sustrato en los casos a, c-e y f en TS1 son -0,57, ≈-0,43 y -0,37, respectivamente. Así, la carga negativa del sustrato se reduce más en presencia de dos residuos catalíticos. Esta reducción surge de la transferencia del exceso de electrones del sustrato a los residuos catalíticos con gran afinidad electrónica, que desempeñan el papel de tampón para el exceso de electrones. Aunque Asp tiene un mayor poder de atracción de electrones que Tyr, Tyr tiene menor afinidad por los electrones que Asp. Por lo tanto, Tyr es tan eficaz o ligeramente más eficaz que Asp en la reducción de la barrera de activación. La estabilización de las TSs y EIs en presencia de residuos catalíticos está altamente correlacionada con la disminución de la energía del estado de exceso de electrones, ya que el espacio para acomodar el exceso de electrones se amplía con residuos catalíticos además del sustrato. Esta disminución de la energía está directamente relacionada con el principio de incertidumbre; cuanto menos localizado está el exceso de electrones, más se estabiliza.

Los desplazamientos químicos calculados (δ) se encuentran algo correlacionados con el valor más pequeño de d(O3-Or) para el mismo número de enlaces H , mientras que la presencia del segundo enlace H aumenta δ debido al efecto de cribado mejorado. Sobre la base de nuestros resultados, un valor grande de δ puede ser a menudo un buen indicador de SSHB, pero δ sólo está parcialmente correlacionado con kcat. Esta correlación disminuye particularmente para δ grande (>16 ppm) o valor absoluto pequeño de ΔrH (<0,5 Å), ya que la dependencia de kcat en δ ha sido cuestionada (50).

La disminución de las barreras de activación en presencia de residuos catalíticos se entiende bien a partir del análisis de MO (Fig. 3). La sorprendente distinción en los niveles de energía de la MO de TS2 entre a y g surge de la naturaleza cuántica del exceso de densidad electrónica acumulada en el sustrato a través de la desprotonación por Asp-40. La estabilización resultante obtenida por la disipación de parte de la densidad de electrones a los residuos catalíticos se debe al principio de incertidumbre mencionado anteriormente, que es similar a lo que se observa en el caso de un exceso de electrones que interactúan con los cúmulos de agua (51, 52), que está a favor de un espacio de cavidad razonablemente grande. Así, la presencia de los residuos catalíticos (que desempeñan el papel de amortiguación de la carga mediante la transferencia parcial de electrones desde el sustrato a los residuos catalíticos) reduce drásticamente la acumulación de carga en el oxianión. Esta estabilización de los EIs y TSs es esencialmente asistida por los SSHBs. Este efecto es altamente potenciado en presencia de Asp-103 y Tyr-16/57. Las energías de MO del caso g son por tanto mucho más bajas que las del caso a. El efecto del medio dieléctrico de la enzima no es tan drástico como el efecto del residuo catalítico que implica la transferencia de electrones. Así, las lanzaderas parciales de protones y las redistribuciones de carga promovidas por los SSHB son más responsables de la disminución de los TS y EI que el efecto dieléctrico de la enzima. En consecuencia, el efecto catalítico resulta de una combinación favorable de ganancias de energías electrostáticas no inducidas y de energías de interacción de MO (polarización, transferencia de carga y energía de enlace covalente). Mientras que la primera resulta de las lanzaderas parciales de protones debido a la presencia de enlaces H cargados (y, por tanto, relacionada con la fuerza de los SSHB), la segunda resulta principalmente de la deslocalización electrónica debido a los residuos catalíticos, que desempeñan el papel de tampón para un exceso de electrones. La ganancia de energía de la interacción MO está estrechamente relacionada con la interacción adicional enzima-sustrato promovida por SSHB.

La energía de estabilización puede representarse así como la suma de la energía mejorada del enlace H cargado (que implica especies iónicas) de EIs/TSs en relación con el enlace H normal (entre socios neutros) del ES y la ganancia de energía de la interacción MO debido a las redistribuciones de carga que implican la disipación de electrones a los residuos catalíticos. Dado que los dos términos energéticos no son fácilmente separables, es difícil estimar cada término. Sin embargo, evaluamos dichos términos en el caso d utilizando el siguiente método. A partir de la comparación de las energías de EI1 en relación con ES en ausencia y presencia de Tyr-16 (Y16), la energía de estabilización de EI1 por Y16 es de 8,7 kcal/mol. Para investigar la contribución de la interacción electrostática no inducida (que no incluye el efecto de inducción electrostática del sustrato + Asp-40 (D40) sobre el residuo Y16) a la estabilización, llevamos a cabo los cálculos del ES y del EI1 en el caso en que Y16 es sustituido por un residuo fantasma compuesto únicamente por sus cargas orbitales de enlace natural (NBO) (Y16q), que se calcularon para una única molécula Y16 en ausencia de sustrato + D40. Entonces, la ganancia de energía de interacción electrostática no inducida (o ganancia de energía electrostática impulsada por la preorganización) es de 4,4 kcal/mol, que es responsable de la mayor fuerza de enlace del enlace H cargado (es decir, el propio SSHB). Entonces, la diferencia en las energías de estabilización entre el efecto cuántico completo por Y16 y el efecto electrostático no inducido por Y16q (4,3 kcal/mol) debe provenir de la energía de interacción electrostática inducida, la energía covalente, etc. La interacción electrostática inducida incluye los efectos de polarización y transferencia de carga. Para obtener la ganancia de energía electrostática inducida, primero obtuvimos las cargas atómicas de Y16 (Y16qind), que incluye el efecto de inducción en presencia del sustrato + D40. A continuación, realizamos los cálculos de la ES y la EI1 en el caso de que Y16 sea sustituido por un residuo fantasma (Y16qind) compuesto únicamente por sus cargas atómicas puntuales. Dado que esta energía de estabilización es de 8,2 kcal/mol, la ganancia de energía electrostática inducida por la interacción entre sustrato + D40 e Y16 es de 3,8 kcal/mol. Así, la ganancia de energía por la transferencia de carga y la polarización es grande y comparable a la ganancia de energía electrostática no inducida. El residuo Y16 desempeña un importante papel catalítico de tampón de carga para retirar y mantener una gran parte del exceso de carga negativa en el sustrato, así como de la correspondiente redistribución de carga electrónica durante la reacción. Esta energía electrostática inducida surge de la energía de interacción MO por la interacción mecánica cuántica de carga electrónica entre el residuo catalítico (Y16) y el sustrato + D40 (es decir, la energía de interacción sustrato-residuo impulsada por SSHB). Por último, la contribución energética restante de 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol podría corresponder principalmente a la energía covalente no electrostática. Esta energía es bastante pequeña, lo que se ve corroborado por nuestro análisis de MO de que el solapamiento orbital no electrostático en el propio SSHB no es significativo.

En las enzimas que implican un mecanismo de reacción de dos pasos, un sustrato no está totalmente cargado negativamente, sino que es parcialmente aniónico con disipación de electrones a los residuos catalíticos. Por lo tanto, en este caso el incremento de energía de estabilización (≈10 kcal/mol en EI1) impulsado por SSHB en relación con el enlace H normal resulta no ser pequeño . Si la energía SSHB se amplía para incluir las interacciones sustrato-residuo debido a las redistribuciones de carga tanto en el sustrato como en el residuo, la energía de estabilización es la suma de la energía SSHB impulsada por la preorganización y la energía de interacción MO impulsada por SSHB. Sin embargo, si consideramos sólo la fuerza del SSHB en sí, el incremento de la energía de unión se reduce mucho (a ≈5 kcal/mol).