Materiales y métodos

Recogida de muestras

Se invitó a los participantes mayores de 18 años a participar en el estudio mediante notificaciones por correo electrónico y anuncios colocados en los tablones de anuncios de la Universidad de Columbia Británica, Vancouver BC. Se pidió a los participantes que proporcionaran muestras utilizando hisopos bucales con cierre seco (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) y hisopos bucales con punta de esponja (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) siguiendo instrucciones autoguiadas; el orden en el que se entregaron estas muestras fue aleatorio por ordenador. Un asistente de investigación estuvo presente durante la toma de muestras para responder a las preguntas de los participantes sobre las instrucciones para la toma de muestras. Todas las muestras se almacenaron a temperatura ambiente. No se entregaron informes farmacogenéticos a los participantes, ya que esto no entraba en el ámbito de este estudio.

Extracción de ADN

El ADN se extrajo utilizando el kit de extracción de ADN basado en perlas Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. El ADN se extrajo 3 días después de la recogida de la muestra y se eluyó en 60 µl. La cantidad y la calidad del ADN se evaluaron mediante el ensayo de fluorescencia Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). La pureza de las muestras se determinó mediante los valores de densidad óptica A260/280 (ODA260/280) utilizando el espectrofotómetro NanoVue.

El genotipado

El genotipado se realizó en el instrumento de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) QuantStudio 12K Flex (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) con ensayos validados por el fabricante (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). El contenido de los ensayos incluyó 28 SNPs que influyen en la respuesta al fármaco en la plataforma OpenArray (véase el archivo adicional 2) y un ensayo TaqMan de CYP2D6 CNV (ID del ensayo: Hs_00010001_cn). Para validar los ensayos, se genotipificaron 44 controles de ADN del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), Repositorio de Células Genéticas Humanas del Instituto Coriell de Investigación Médica. Se confirmó la concordancia de las llamadas con el genotipo esperado. Además, la secuenciación Sanger del ADN de control verificó los resultados. Para cada ejecución, las muestras de los participantes se ejecutaron por duplicado en el OpenArray y por cuadruplicado en el ensayo CNV junto con las muestras de ADN de Corriell utilizadas como controles positivos y controles sin plantilla (NTC).

Análisis estadístico

El software TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) se utilizó para determinar las tasas de llamadas de genotipos SNP en el OpenArray. La tasa de llamadas de genotipos se calculó para cada ensayo OpenArray, dividiendo el número total de genotipos asignados con éxito por el número total de intentos de asignación de genotipos.

Para el ensayo CNV TaqMan se utilizó el software CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) para asignar las llamadas de número de copias de CYP2D6 y las puntuaciones de confianza de CNV. A las muestras de ADN se les asignó un número de copia diploide de tipo salvaje y la variación del número de copia (eventos de deleción o duplicación) se agrupó en los grupos 2N y CNV, respectivamente. Se estableció una tasa de llamadas de genotipado del 95% y una puntuación de confianza del 95% para los resultados de genotipado de SNP y CNV, respectivamente. Se calculó una prueba t de Student de dos muestras asumiendo varianzas desiguales para determinar la diferencia significativa entre el rendimiento del ADN, la pureza y las tasas de llamada de los diferentes tipos de ADN en pares. Se compararon las asignaciones de genotipado generadas a partir del tipo de muestra de ADN (con punta de esponja vs. con bloqueo seco) del mismo participante para calcular la concordancia.

Resultados

Se reclutaron 31 participantes que recogieron hisopos con punta de esponja y hisopos con bloqueo seco. Los participantes consideraron que las instrucciones autoguiadas para la recogida eran sencillas y fáciles de seguir para ambos tipos de hisopos. Los participantes plantearon preguntas sobre la presión necesaria para frotar los hisopos y la colocación correcta de los hisopos en la boca. Los comentarios de los participantes sobre los dos hisopos fueron similares, algunos prefirieron los hisopos con punta de esponja y otros prefirieron los hisopos con cierre seco; no hubo consenso de opinión.

Hubo una diferencia significativa en el rendimiento medio de ADN entre el ADN recogido con hisopos con cierre seco frente a los hisopos con punta de esponja (0,26 ± 0,34 µg frente a 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabla 1). La pureza media del ADN en todos los tipos de recogida se situó en el rango aceptado para el ADN puro (media (SD)) 1,72(0,78) y 1,85(0,39) para los hisopos secos y los hisopos con punta de esponja, respectivamente.

Hubo tres muestras recogidas de hisopos con punta de esponja que tenían concentraciones bajas de ADN (< 5 ng/µl). Estas tres muestras tenían tasas de llamadas de genotipado del 100% en el OpenArray y puntuaciones de confianza del 100% en la CNV (Fig. 1). Por el contrario, una de las muestras que tenía una concentración de ADN de 79 ng/µl tuvo la tasa de llamadas OpenArray más baja (18%). Las tasas más altas de llamadas en el OpenArray (> 95%) para los hisopos bloqueados en seco se observaron en siete muestras con una concentración que oscilaba entre 1,2 y 8,9 ng/µl (Fig. 1a). Las llamadas de confianza de VNC más altas (> 95%) se observaron para muestras con una concentración que oscilaba entre 1,0 y 24,4 ng/µl (Fig. 1b).

Para todos los ensayos del OpenArray, Las muestras de ADN recogidas con hisopos con punta de esponja dieron lugar a tasas de llamada de genotipo más altas (97%) en comparación con los hisopos con punta seca (54%) (Fig. 2). Con un paso añadido de una dilución de 0,5 × del ADN extraído, los hisopos con punta de esponja tuvieron una tasa de llamadas de genotipado consistente > 95%. La tasa de llamada de la muestra en el OpenArray varió según el individuo, con 29 (93,5%) participantes con tasas de llamada de la muestra > 95% del ADN del hisopo con punta de esponja y 4 (12,9%) con tasas de llamada de la muestra > 95% del ADN del hisopo bloqueado en seco. Se observó una concordancia del 94% de los ensayos de genotipado con éxito entre los hisopos con punta de esponja y los hisopos con cierre seco recogidos del mismo individuo.

Las llamadas de número de copia para CYP2D6 se asignaron a 2(6,5%) de las muestras de los hisopos con punta de esponja con una puntuación de confianza general de 0,99. En comparación, se asignaron llamadas de número de copias a 8 (25,8%) de las muestras de hisopos con punta seca con una puntuación de confianza general de 0,91 (véase el archivo adicional 3).

Discusión

El propósito de esta investigación es ayudar a los investigadores, y a las empresas, a identificar un método de recogida óptimo que produzca ADN de alta calidad para el genotipado. Este estudio proporciona nueva información sobre la calidad del ADN para dos tipos de hisopos, que fue alta (definida como ODA260/A280 1,8) aunque hubo una diferencia significativa en el rendimiento del ADN (valor p = 4,4-7). En la plataforma OpenArray, los hisopos con punta de esponja tuvieron la mayor tasa global de llamadas de genotipado (97% frente al 54%) y la mayor puntuación de confianza para el ensayo TaqMan CYP2D6 CNV (0,99 frente a 0,91). Se considera que una tasa de coincidencia de genotipos SNP de > 95% refleja datos de calidad aceptable y una puntuación de confianza de CNV de 99% se considera de alta calidad.

Una muestra de ADN aislada del hisopo con punta de esponja tuvo una tasa de coincidencia inferior al 95%. En la práctica rutinaria del laboratorio, las muestras con tasas de llamada bajas se recogerían debido a los resultados incompletos para los informes de los pacientes. La omisión de esta muestra aumentó la tasa global de llamadas de genotipado al 99,5% para los hisopos con punta de esponja.

Los resultados de CNV deCYP2D6 mostraron un aumento de las asignaciones de CNV para el ADN recogido de los hisopos con cierre seco 8(25,8%) en comparación con los hisopos con punta de esponja 2(6,5%). El mayor número de asignaciones de VNC se correlacionó con puntuaciones de confianza más bajas. La mayoría de los participantes, 30 (97%), fueron capaces de recoger muestras que dieron lugar a elevadas tasas de llamadas de genotipado para el hisopo con punta de esponja, mientras que sólo unos pocos individuos, 4 (13%), fueron capaces de recoger muestras con elevadas tasas de llamadas para ambos tipos de hisopos. En conclusión, los hisopos con punta de esponja fueron aceptables para los pacientes y proporcionaron ADN de buena calidad con un rendimiento suficiente para las pruebas farmacogenéticas basadas en la qPCR.