La protrombina desempeña un papel fundamental en la coagulación sanguínea (Fig. 1, 2). Sus propiedades funcionales están relacionadas con la presencia de residuos de gamma-carboxiglutamilo (Gla), que resultan de la carboxilación postraduccional dependiente de la vitamina K de diez residuos de glutamilo específicos (Fig. 3,4). Mis estudios en bovinos (por ejemplo, examinando la relación entre la unión de iones metálicos y la función de la proteína dentro del complejo «»»»»»»»prothrombinase»»»»»»»») diferenciarán entre la ligadura y la posterior participación conformacional de los residuos Gla en el proceso fisiológico normal. Dentro de este marco, aislé y caractericé previamente seis variantes diferentes de protrombina deficientes en Gla (0-,1-,2-,3-,5- y 7-Gla). Cada una de ellas generó trombina cuantitativamente, pero a una velocidad notablemente más lenta (alta K/m) que la protrombina 10-Gla, debido a la fuerte disminución de la unión de Ca/2+ y fosfolípidos en comparación con la protrombina 10-Gla normal. Las variantes de siete y menos Gla revelaron sólo un 3% de la actividad normal de la protrombina, cuando se midió por su capacidad de acelerar la coagulación de la protrombina y del plasma deficiente de Factor VII. Las protrombinas recién aisladas de 8 y 9 Gla poseen, respectivamente, un 18 y un 75% de la actividad normal, proporcionando una transición entre las protrombinas de 7 y 10 Gla. El aislamiento de las variantes 8- y 9-Gla fue posible gracias a la utilización de anticuerpos monoclonales (McAb) contra la estructura estabilizada por el Ca2+ (Ca II Ab) de la protrombina para la cromatografía de inmunoafinidad. Mis estudios inmunoquímicos con Ca II Ab, policlonales y monoclonales, han demostrado que (los policlonales) no son específicos para la protrombina normal, ya que reaccionan de forma cruzada con las variantes 7-, 8- y (especialmente) 9-Gla. Además, mis datos preliminares con protrombinas de 5- y 7-Gla sugieren que las posiciones 15 y 17 de Glu no están modificadas, y que las posiciones selectivas (residuos 7,8,20,30,33) pueden estar preferentemente carboxiladas. La investigación propuesta revelará si las protrombinas deficientes en Gla son realmente deficientes de forma selectiva, indicando el orden de «»»»»»»»in vivo»»»»»»»» carboxilación de los residuos de Glu. Mi experiencia en la descripción de cómo la posición y/o el número de residuos Gla afectan a las propiedades funcionales, fisicoquímicas (conformacionales) e inmunoquímicas de la protrombina y del fragmento 1 que contiene Gla constituye la base para el aislamiento de materiales humanos tanto para estudios básicos como clínicos. Aislaré protrombinas normales y las más importantes con deficiencia de Gla. Estas últimas se dividirán en dos (o más) grupos según su actividad fisiológica. El objetivo será monitorizar el plasma de los pacientes en tratamiento con warfarina para las protrombinas normales, 9-Gla (si ésta es la única que es funcionalmente activa y total (normal más Gla-deficiente) mediante inmunoensayos con anticuerpos monoclonales específicos para evaluar el estado hemostático de estos pacientes.
El objetivo es determinar por qué algunos pacientes presentan episodios trombóticos mientras que otros siguen siendo más propensos a las hemorragias, aunque su bioactividad de protrombina plasmática se mantenga en niveles clínicamente aceptables. Además, las protrombinas deficientes en Gla pueden proporcionar otro marcador de disfunción hepática.