ABSTRACT

Antes de la ligadura, cada fragmento Okazaki sintetizado en la hebra rezagada en eucariotas debe ser procesado nucleolíticamente. La escisión por nucleasas tiene lugar en el contexto de las estructuras de solapa 5′ generadas a través de la síntesis de desplazamiento de la hebra por la ADN polimerasa delta. Al menos tres nucleasas de ADN: Rad27 (Fen1), Dna2 y Exo1, han sido implicadas en el procesamiento de los colgajos del fragmento Okazaki. Sin embargo, no se han definido claramente in vivo ni las contribuciones de las nucleasas individuales a la síntesis de la hebra rezagada ni la estructura de los intermedios de ADN formados en su ausencia. Mediante el agotamiento condicional de las nucleasas de la hebra retrasada y el análisis directo de los fragmentos Okazaki sintetizados in vivo en S. cerevisiae, realizamos una evaluación sistemática del impacto de Rad27, Dna2 y Exo1 en la síntesis de la hebra retrasada. Descubrimos que Rad27 procesa la mayoría de los colgajos de la hebra rezagada, con una importante contribución adicional de Exo1 pero no de Dna2. Cuando el corte de la nucleasa se ve afectado, observamos una reducción en la síntesis de la hebra, en contraposición a la generación generalizada de largos fragmentos de Okazaki en los flaps 5′, tal y como predicen algunos modelos. Además, utilizando construcciones restringidas al ciclo celular, demostramos que tanto el procesamiento nucleolítico como la ligadura de los fragmentos Okazaki pueden desacoplarse de la replicación del ADN y retrasarse hasta después de que se haya completado la síntesis de la mayor parte del genoma.