Efectos del modafinilo sobre el comportamiento y los parámetros de daño oxidativo en el cerebro de ratas Wistar
Abstract
Se evaluaron los efectos del modafinilo (MD) sobre el comportamiento y el daño oxidativo de las proteínas y los lípidos en el cerebro de las ratas. Las ratas Wistar recibieron una única administración por gavage de agua o MD (75, 150, o 300 mg/kg). Se evaluaron los parámetros conductuales en aparatos de campo abierto 1, 2 y 3 h después de la administración del fármaco. Se midieron las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la formación de carbonilo proteico en el cerebro. La DM aumentó la actividad locomotora a la dosis más alta 1 y 3 h después de la administración. La administración de DM a la dosis de 300 mg/kg aumentó las visitas al centro de campo abierto 1 h después de la administración; sin embargo, 3 h después de la administración, todas las dosis administradas de DM aumentaron las visitas al centro de campo abierto. La DM de 300 mg/kg aumentó el daño lipídico en la amígdala, el hipocampo y el estriado. Además, la DM aumentó el daño proteico en el córtex prefrontal, la amígdala y el hipocampo; sin embargo, este efecto varía en función de la dosis administrada. Por el contrario, la administración de 75 y 300 mg/kg de DM disminuyó el daño proteico en el estriado. Este estudio demostró que la administración de DM induce cambios conductuales, que dependían de la dosis utilizada. Además, los efectos de la DM sobre los parámetros de daño oxidativo parecían darse en regiones cerebrales y dosis específicas.
1. Introducción
El modafinilo (MD) es un fármaco psicoactivo no anfetaminérgico que se prescribe con frecuencia para el tratamiento del sueño, como la narcolepsia, el síndrome de apnea obstructiva del sueño y el trastorno del sueño por turnos . Además, está bien descrito en la literatura que la DM mejora la función en una serie de dominios cognitivos, así como la memoria de trabajo y la memoria episódica . Estos efectos de la DM sobre la memoria también se han descrito en pacientes psiquiátricos, lo que sugiere que este fármaco es un excelente agente candidato para el tratamiento de la disfunción cognitiva en los trastornos psiquiátricos . Además, la investigación clínica ha demostrado que la DM mejora los síntomas en pacientes con depresión mayor, trastorno bipolar, esquizofrenia y trastorno por déficit de atención/hiperactividad (TDAH).
El mecanismo de acción de la DM es poco conocido; sin embargo, se sabe que este fármaco tiene un importante efecto sobre los sistemas de catecolaminas, serotonina, glutamato, ácido gamma aminobutírico, orexina e histamina en el cerebro. Además, los estudios muestran que la DM inhibe el transportador de dopamina, aumentando la neurotransmisión dopaminérgica en los circuitos de vigilancia. Los psicoestimulantes como la anfetamina, que también actúan sobre varios sistemas neurotransmisores, han demostrado tener un efecto pronunciado sobre el comportamiento, incluyendo la generación de miedo, ansiedad e hiperactividad . Sin embargo, la DM está menos relacionada con efectos secundarios como la hiperactividad, la ansiedad, el nerviosismo o los efectos de rebote que los estimulantes tradicionales.
Varios estudios sugirieron que la administración de psicoestimulantes puede provocar estrés oxidativo en el cerebro de las ratas. El cerebro es especialmente vulnerable a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) porque metaboliza el 20% del oxígeno corporal total y tiene una capacidad antioxidante limitada . La administración crónica de psicoestimulantes como el metilfenidato, la m-anfetamina y la d-anfetamina en ratas indujo un aumento de la producción de superóxido, daños oxidativos en las proteínas, los lípidos y el ADN, y cambios en las enzimas antioxidantes y los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial .
Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la DM sobre el comportamiento y los parámetros de estrés oxidativo en el hipocampo, la corteza prefrontal, la amígdala y el estriado de las ratas.
2. Métodos experimentales
2.1. Animales
Los sujetos eran ratas Wistar macho adultas (con un peso de 250-350 g) obtenidas de nuestra colonia de cría. Los animales se alojaron como cinco en una jaula con comida y agua disponibles ad libitum y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 7:00 a.m.) a una temperatura de °C. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con la aprobación del Comité de Ética local en el uso de animales de la Universidade do Extremo Sul Catarinense. Todos los experimentos se realizaron a la misma hora del día para evitar variaciones circadianas.
2.2. Fármacos y procedimientos farmacológicos
La DM (Libbs Farmacêutica Ltda) se suspendió en el vehículo-vehículo: Metilcelulosa al 1% en agua. Las soluciones se prepararon inmediatamente antes de su uso y se protegieron de la luz durante la sesión experimental. La solución suspendida estuvo bajo agitación durante todo el período de inyección. El grupo de control recibió el vehículo.
2.3. Diseño experimental
El número total de ratas utilizadas en este experimento fue de 40 ( animales por grupo). Los animales recibieron una dosis única de DM (75, 100 o 300 mg/kg de peso corporal) en un volumen de 1 mL/kg, administrada por sonda. El grupo de control recibió vehículo en un volumen de 1 mL/kg. La actividad locomotora se midió 1, 2 y 3 h después de la inyección, y las ratas fueron sacrificadas por decapitación justo después de la tarea en campo abierto.
2.4. Actividad locomotora
La actividad locomotora se evaluó utilizando la tarea de campo abierto como se ha descrito previamente . Esta tarea se llevó a cabo en un campo abierto de 40 × 60 cm rodeado de paredes de 50 cm de altura, hechas de madera contrachapada marrón, con el suelo dividido en 9 cuadrados iguales por líneas negras. Los animales fueron colocados suavemente en el rectángulo trasero izquierdo y se les dejó libres para explorar la arena durante 5 minutos. En la prueba de campo abierto, se evaluaron los siguientes parámetros de comportamiento.
Cruces (actividad locomotora/actividad horizontal): se contó el número total de cuadrados cruzados por las ratas en todo el período de prueba.
Cruces (actividad exploratoria/actividad vertical): se contó el total de posturas erectas de las ratas en todo el período de prueba.
Visitas al centro del campo abierto: se contó el número total de visitas al centro del campo abierto. Se definió un cuadrado central de cm como el área «central» del campo.
2.5. Medición de marcadores de daño oxidativo
Las ratas fueron tratadas con DM o agua como se ha descrito anteriormente y fueron sacrificadas por decapitación 3 h después de la última inyección y sus cerebros fueron extraídos y disecados para la evaluación de los niveles de daño oxidativo en el córtex prefrontal, la amígdala, el hipocampo y el estriado. Se midieron el TBARS y las formaciones de carbonilo de las proteínas como se ha descrito anteriormente.
2.6. Sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Se midió la formación de TBARS durante una reacción de calentamiento de ácido como índice de producción de ROS, que se adopta ampliamente como método sensible para la medición de la peroxidación lipídica, como se ha descrito previamente . Brevemente, las muestras se mezclaron con 1 mL de ácido tricloroacético al 10% (TCA) y 1 mL de ácido tiobarbitúrico al 0,67% (TBA) y luego se calentaron en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Los TBARS se determinaron mediante la absorbancia a 535 nm. Los resultados se expresan como equivalentes de MDA (malondialdehído) (nmol/mg de proteína).
2.7. Medición de los carbonilos de las proteínas
El daño oxidativo de las proteínas se evaluó mediante la determinación de los grupos carbonilo a partir de la reacción con dinitrofenilhidrazina (DNPH) como se ha descrito previamente . Brevemente, las proteínas se precipitaron mediante la adición de ácido tricloroacético al 20% y se redisolvieron en DNPH y se leyó la absorbancia a 370 nm.
2,8. Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico para ciencias sociales versión 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Todos los datos se presentan como media ± SEM. Las diferencias entre grupos en el análisis del comportamiento se verificaron mediante un análisis de varianza de medidas repetidas para acceder a la curva de respuesta temporal, seguido de las pruebas post hoc de Tukey. Para comprobar las diferencias entre grupos en el análisis bioquímico, se utilizó el ANOVA, seguido de las pruebas post hoc de Tukey. En todos los experimentos, se consideró que los valores < 0,05 indicaban significación estadística.
3. Resultados
3.1. Análisis del comportamiento
Para el análisis de la locomoción (cruces) (Figura 1(a)), el análisis de varianza de medidas repetidas reveló diferencias significativas para la administración de DM (F(3,35) = 7,91, ) y para las repeticiones del comportamiento (F(2,7) = 54,82, ). Otros análisis con la prueba post hoc de Tukey mostraron que la DM a 300 mg/kg aumentó la locomoción espontánea de las ratas en comparación con el grupo de control 1 h después de la administración. Además, el grupo de control, el de MD a 75 mg/kg y el de MD a 150 mg/kg mostraron un menor número de cruces cuando fueron reexpuestos 3 h después al campo abierto, indicando así la habituación al entorno. Sin embargo, las ratas tratadas con DM a 300 mg/kg mostraron un menor número de cruces cuando fueron reexpuestas 2 y 3 horas después al campo abierto. Esta diferencia puede explicarse por la hiperactividad motora inducida 1 h después de la administración de DM a la dosis de 300 mg/kg.
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Para el análisis de la exploración (rearings) (Figura 1(b)), el análisis de medidas repetidas de la varianza reveló diferencias significativas para las repeticiones del comportamiento (F(2,7) = 32,7, ). Otros análisis con la prueba post hoc de Tukey mostraron que el grupo de control, el de DM a 75 mg/kg y el de DM a 150 mg/kg mostraron un menor número de rearings cuando fueron reexpuestos 3 horas después al campo abierto. La DM a 300 mg/kg disminuyó el número de remetidas cuando se reexpuso 2 y 3 horas después al campo abierto.
Para el análisis de las visitas al centro del campo abierto (Figura 1(c)), el análisis de varianza de medidas repetidas reveló diferencias significativas para la administración de DM (F(3.34) = 15.70, ). Otros análisis con la prueba post hoc de Tukey mostraron que la DM a 300 mg/kg aumentó las visitas al centro del campo abierto en comparación con el control 1 h después de la administración. Además, la DM en todas las dosis administradas aumentó las visitas al centro del campo abierto 3 h después de la administración.
3.2. Análisis bioquímico
Como se muestra en la Figura 2(a), los niveles de TBARS aumentaron significativamente en la amígdala (F(3) = 4,18, ), el hipocampo (F(3) = 44,9, ) y el estriado (F(3) = 7,07, ) de las ratas tratadas con DM a 300 mg/kg en comparación con el grupo control.
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Como puede observarse en la Figura 2(b), se detectó un aumento significativo de la generación de carbonilo tras la administración de DM en la corteza prefrontal (F(3) = 29,9, ) a la dosis de 300 mg/kg y en la amígdala (F(3) = 9,74, ) y el hipocampo (F(3) = 17,99, ) a 75 mg/kg. Por el contrario, el tratamiento con DM a 75 y 300 mg/kg redujo significativamente la generación de carbonilo en el cuerpo estriado (F(3) = 21,93, ) en comparación con el grupo de control.
4. Discusión
En el presente estudio, observamos que una única inyección de DM en una dosis alta (300 mg/kg) induce la hiperlocución en ratas, que no se mantiene 2 y 3 horas después de la administración. Según nuestros resultados, la DM aumentó significativamente la actividad locomotora e incrementó los niveles de dopamina extracelular estriatal en monos rhesus . Young y sus colegas demostraron que la DM aumentó la actividad, el encabalgamiento y la suavidad de las trayectorias locomotoras en ratones C57BL/6J y 129/SJ. Estas alteraciones del comportamiento inducidas por la DM estaban relacionadas con un aumento de la dopamina sináptica y con acciones secundarias mediadas por los receptores de dopamina drd1 y drd4. A diferencia del estudio anterior, aunque existe una tendencia, no observamos un aumento significativo del comportamiento exploratorio tras la administración de DM. Esta discrepancia puede explicarse por las diferencias en la metodología, la especie y el tiempo de tratamiento.
Aquí observamos que el grupo control y la DM a dosis bajas (75 y 150 mg/kg) redujeron el número de cruces y rearings cuando se reexpusieron 3 horas después al campo abierto, indicando la habituación al entorno. La DM en dosis altas (300 mg/kg) redujo el número de cruces y de repliegues cuando se volvieron a exponer 2 y 3 horas después al campo abierto. Esta discrepancia puede explicarse por el hecho de que 1 hora después de la administración de la DM (300 mg/kg) aumentó significativamente el número de cruces y una tendencia a aumentar el número de rearings. Se cree que la habituación a un entorno nuevo es una de las formas más elementales de aprendizaje no asociativo. La exposición repetida al mismo entorno induce una reducción de la conducta exploratoria, que puede tomarse como índice de habituación.
Un hallazgo interesante del presente estudio fue que la DM moduló la conducta relacionada con la ansiedad. En la prueba de campo abierto, las ratas tratadas con DM se mostraron menos ansiosas e incluso tendieron a explorar la zona del centro aversivo más que los controles. La DM a 300 mg/kg aumentó el número de visitas al centro del campo abierto 1 hora después de la administración. Además, la DM en todas las dosis administradas aumentó las visitas al centro del campo abierto 3 h después de la administración. En la literatura, los estudios son controvertidos sobre el efecto de la DM en la ansiedad. Los estudios preclínicos han demostrado que el modafinilo no tiene efectos sobre la ansiedad o que tiene un efecto ansiolítico. Del mismo modo, la DM en los estudios clínicos muestra un efecto ansiolítico o ningún efecto sobre la ansiedad , mientras que otros demuestran un efecto ansiógeno . Esta diferencia entre los estudios puede explicarse por la variación en las dosis utilizadas (100 mg, 200 mg o 400 mg) y en la pauta de dosificación (una vez frente a una dosis crónica durante una semana o más). Los efectos ansiolíticos de la DM pueden explicarse por sus efectos sobre la amígdala, que es una región del cerebro implicada en la ansiedad, ante estímulos amenazantes. Un estudio anterior demostró que la DM disminuye la reactividad de la amígdala ante los estímulos de miedo. Se sabe que la amígdala es rica en proyecciones catecolaminérgicas y serotoninérgicas , y entonces probablemente la DM reduce la reactividad de la amígdala por cambios en la señalización intra-amígdala que resultan de alteraciones en los sistemas de noradrenalina, dopamina, serotonina o GABA o de una combinación de estos efectos.
Además de inducir cambios conductuales, está bien descrito en la literatura que los psicoestimulantes causan daño oxidativo tanto en modelos animales como en humanos . Nuestros resultados muestran que la DM aumenta el daño oxidativo en lípidos y proteínas en el cerebro de las ratas. Los niveles de TBARS aumentaron en la amígdala, el hipocampo y el estriado de las ratas tratadas con DM en dosis altas (300 mg/kg). Además, se observó un aumento de la generación de carbonilo tras la administración de DM en el córtex prefrontal a la dosis de 300 mg/kg y en la amígdala y el hipocampo a 75 mg/kg. Los estudios demuestran que la DM inhibe el transportador de dopamina, aumentando la neurotransmisión dopaminérgica. El aumento de la concentración de dopamina extracelular inducido por la DM puede inducir la sobreproducción del metabolito tóxico de la oxidación de la dopamina , lo que conduce a un daño oxidativo de las proteínas y los lípidos en el cerebro de las ratas. En la literatura, no hay estudios que evalúen las lesiones cerebrales tras la administración de DM; sin embargo, estos estudios son muy importantes dado que la accesibilidad de la DM, como fármaco para mejorar el estado de alerta, la memoria y la antifatiga, para las personas sanas es cada vez mayor.
Por el contrario, el tratamiento con DM (75 y 300 mg/kg) redujo la generación de carbonilo en el estriado en comparación con el grupo de control. Algunos estudios han demostrado el potencial neuroprotector estriatal de la DM. Estudios anteriores muestran una mejora de la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas intoxicadas con 1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridina en el estriado tras el tratamiento con DM, en un modelo animal de la enfermedad de Parkinson. Raineri y sus colegas han demostrado que la administración de DM atenúa la neurotoxicidad inducida por la metanfetamina en el estriado de los ratones, lo que sugiere un posible papel protector de la DM en esta región del cerebro. Se ha demostrado que la DM mejora el aprendizaje en pacientes dependientes de la metanfetamina. Los resultados presentados aquí sugieren que la administración de DM podría mostrar propiedades antioxidantes en el estriado; sin embargo, aún se desconoce el efecto protector de la DM en el estriado. El estriado integra las entradas glutamatérgicas de la corteza y el tálamo con las aferencias dopaminérgicas del cerebro medio. La señalización dopaminérgica desempeña un papel preeminente en el aprendizaje dependiente del estriado y en la plasticidad sináptica de las neuronas de proyección medianas. Rossato y sus colegas demostraron que la infusión del agonista del receptor D1 aumentaba los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y, en consecuencia, la plasticidad sináptica. Así, la DM puede estar promoviendo la plasticidad sináptica mediante la activación del sistema dopaminérgico y, en consecuencia, protegiendo el estriado contra el daño oxidativo.
En conclusión, somos capaces de demostrar que (1) la DM induce hiperactividad a dosis altas (300 mg/kg) 1 h después de la administración, que no se mantiene 2 y 3 horas después de la administración. (2) La DM mostró efectos ansiolíticos en ratas, aumentando el número de visitas al centro del campo abierto. (3) La DM indujo daño oxidativo en lípidos y proteínas en el cerebro de las ratas; sin embargo, el daño oxidativo depende de la región cerebral analizada y de la dosis de DM administrada. (4) Por último, la DM podría proteger el estriado contra el daño oxidativo de las proteínas. Hay que tener precaución al interpretar los resultados. En primer lugar, no se midieron las defensas antioxidantes; dado que este es el primer estudio que examina el impacto de la DM en el estrés oxidativo, reconocemos que podría haber ayudado a interpretar los resultados. Sin embargo, en segundo lugar, la DM se administró a ratas sanas; los efectos de la DM sobre el daño oxidativo en modelos animales de enfermedad mental pueden mostrar resultados diferentes.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
El Laboratorio de Neurociencias (Brasil) es uno de los centros del Instituto Nacional de Medicina Traslacional (INCT-TM) y uno de los miembros del Centro de Excelencia en Neurociencias Aplicadas de Santa Catarina (NENASC). Esta investigación fue apoyada por subvenciones del CNPq, la FAPESC, el Instituto Cérebro e Mente y la UNESC. João Quevedo es becario de investigación del CNPq y Roger B. Varela, Wilson R. Resende y Amanda V. Steckert son titulares de una beca CAPES; Samira S. Valvassori es titular de una beca del CNPq.