Los cromosomas sexuales de los mamíferos tienen funciones especializadas en el desarrollo de las células germinales masculinas (XY) y femeninas (XX) (1). Las anomalías de los cromosomas sexuales son la causa genética más común de la infertilidad humana (2). En las trisomías de los cromosomas sexuales (SCT), el síndrome de Klinefelter (XXY) y el síndrome de doble Y (XYY), la espermatogénesis se ve alterada por un exceso de genes X e Y, respectivamente (2). Los hombres XYY suelen ser fértiles debido a la pérdida espontánea del cromosoma sexual extra (mosaicismo). En los hombres XXY, el mosaicismo es menos frecuente. La recuperación de esperma testicular ha permitido la reproducción de algunos hombres Klinefelter jóvenes, pero tiene menos éxito en los pacientes mayores (3, 4). Los individuos XXY y XYY sin células germinales XY son infértiles.

Para estudiar la infertilidad SCT, generamos ratones XXY y XYY adultos portadores de los transgenes reporteros fluorescentes Blimp1-mVenus (BV) y Stella-ECFP (SC) (5) para monitorizar la diferenciación de las células madre pluripotentes en células similares a las células germinales primordiales (PGCLC) (6). Los machos XXY se crearon mediante el apareamiento de una hembra de tipo salvaje con un macho con una variante del cromosoma sexual que produce esperma que contiene XY (fig. S1). La generación de ratones XYY requiere la herencia de un cromosoma Y de ambos padres. Por tanto, utilizamos un cromosoma Y de tipo salvaje heredado paternalmente y un cromosoma Yd1 heredado maternalmente que no expresa el determinante testicular Sry (fig. S1) (7). Como se ha demostrado anteriormente (8, 9), el fenotipo de la espermatogénesis en ambos modelos recapitulaba el de los hombres SCT, con una detención en la fase prospermatogonial en los ratones XXY y en el paquineo en los ratones XYY (fig. S2). La espermatogénesis fue normal en los hermanos transgénicos XY BVSC.

A continuación, establecimos fibroblastos de ratones SCT y de ratones XY y XX de control (Fig. 1A). La hibridación in situ con fluorescencia de ADN (DNA-FISH) para el gen X Slx y el gen Y Sly confirmó que los fibroblastos SCT de pasaje 4 (P4) y los de control habían conservado sus complementos cromosómicos sexuales originales (Fig. 1B y fig. S3A). Los fibroblastos fueron reprogramados a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) (10) de manera inducible por doxiciclina (Dox). Se realizó DNA-FISH en las iPSCs P2 resultantes (Fig. 1A).

Una alta proporción de líneas iPSC derivadas de SCT mostraron pérdida de cromosomas sexuales. A partir de ratones XXY, observamos iPSCs XY, XX y XO (Fig. 1, C y E). La incidencia de la pérdida fue similar para los cromosomas X e Y (P = 0,062, prueba de Mann-Whitney). A partir de ratones XYY, observamos iPSCs XY y XO (Fig. 1, D y E). La pérdida del cromosoma Y en los machos XYY se produjo con una frecuencia similar a la observada para el cromosoma X e Y combinados en los machos XXY (P = 0,089, prueba de Mann-Whitney). A continuación, comparamos la incidencia de la pérdida de cromosomas sexuales entre las iPSCs derivadas de SCT y las euploides XY y XX. La pérdida de cromosomas sexuales fue más común en las iPSCs derivadas de SCT que en las derivadas de euploides (Fig. 1E), independientemente del punto de corte utilizado para definir la pérdida de cromosomas sexuales (fig. S12D).

La pérdida de cromosomas sexuales podría producirse durante la reprogramación de las células SCT o durante la propagación de las iPSCs a P2, confiriendo quizás una ventaja proliferativa a las células euploides resultantes. De hecho, se ha observado la inestabilidad de los cromosomas sexuales en las células madre pluripotentes (11, 12). Para comprobar esta última hipótesis, analizamos la estabilidad del cromosoma sexual entre P2 y P6 en iPSCs con complementos altamente parentales (>90%) (fig. S4A). Observamos una pérdida de cromosomas sexuales en las líneas iPSC XX y XXY (P < 0,01 y 0,05, respectivamente; prueba de rango con signo de Wilcoxon), pero no en las líneas iPSC XY y XYY (P = 0,21 y 0,66, respectivamente; prueba de rango con signo de Wilcoxon). Sin embargo, ninguna línea iPSC mostró más de un 15% de disminución del complemento parental (fig. S4B). Además, la pérdida de cromosomas sexuales entre P2 y P6 no tuvo un sesgo trisómico (fig. S4B). Las iPSCs XY euploides derivadas de SCT tampoco mostraron ninguna ventaja proliferativa sobre las iPSCs XXY o XYY (fig. S5). Dado que los fibroblastos SCT también eran estables desde el punto de vista cariotípico (Fig. 1B y fig. S3A), es probable que la pérdida de cromosomas se induzca durante la reprogramación de las iPSC y, por lo tanto, es distinta de la inestabilidad de los cromosomas sexuales en las células madre pluripotentes (11, 12). Nos referimos a este fenómeno como pérdida cromosómica con sesgo de trisomía (TCL).

A continuación, determinamos si las iPSCs XY euploides derivadas de fibroblastos SCT formarían espermatozoides funcionales. Seleccionamos iPSCs P6 altamente euploides (≥80% de las células XY) adaptadas al medio libre de Dox (fig. S6). Para nuestros experimentos XYY, sólo se utilizaron líneas iPSC XY que conservaban el cromosoma Y de tipo salvaje en lugar del Yd1 para los experimentos PGCLC (fig. S7). El cariotipo confirmó que todas las líneas iPSC XY derivadas de SCT y una línea iPSC XY de control eran euploides (fig. S8). Estas líneas iPSC se diferenciaron (6) a través de un estado similar al epiblasto para crear agregados PGCLC positivos para BV y SC (Fig. 2A). Las PGCLC positivas para BV (tabla S1) se aislaron mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Fig. 2B) y se trasplantaron a testículos con deficiencia de células germinales W/Wv (mutante Kit) (13).

La espermatogénesis en los receptores se evaluó entre 9 y 10 semanas después del trasplante. Los teratomas, que se observan tras el trasplante de PGCLC derivadas de iPSC (6), estaban presentes en el 29% de las líneas trasplantadas derivadas de XXY y en el 50% de las derivadas de XYY (fig. S9). La reconstitución de la espermatogénesis, revelada por la presencia de colonias espermatogénicas (Fig. 2C) y por la histología (Fig. 2D), se observó en todas las líneas de iPSC derivadas de XXY y XYY utilizadas (Tabla 1). Por lo tanto, las iPSCs XY derivadas de SCT pueden diferenciarse a células germinales in vitro y completar la espermatogénesis después del trasplante.

Nos preguntamos si los espermatozoides creados mediante trasplante podían favorecer la reproducción. La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) utilizando esperma de dos líneas iPSC XXY- y dos XYY-derivadas (Fig. 2E y fig. S10A) generó cigotos que se desarrollaron en embriones de dos células in vitro (eficiencia 76.7 a 87,3%) (Fig. 2F, fig. S10B, y tabla S2) y una descendencia groseramente normal cuando se trasplantó a receptores (eficiencia 46,9 a 59,4%) (Fig. 2G, fig. S10C, y tabla S2). La reacción en cadena de la polimerasa confirmó que la descendencia procedía de los PGCLC trasplantados (fig. S10D). Las crías de las líneas de iPSCs derivadas de XXY y XYY mostraron un crecimiento comparable al de las derivadas de iPSCs XY de control (fig. S10E). En particular, las crías derivadas de XXY y XYY tenían complementos euploides (XY o XX) (fig. S11). Tres machos maduros y tres hembras de cada línea iPSC derivada de XXY- y XYY se aparearon entre sí, y todos fueron fértiles (Fig. 2H y fig. S10F). Por lo tanto, los espermatozoides de iPSCs XY derivadas de SCT dan lugar a una descendencia cromosómicamente normal, sana y fértil.

Nos planteamos si la TCL es específica de la trisomía de los cromosomas sexuales. Dado que no se dispone de modelos de ratón con trisomía para un autosoma completo (14), repetimos nuestros experimentos en ratones transcromosómicos Tc1 macho, un modelo de síndrome de Down con un cromosoma 21 humano accesorio (hChr.21) (15). Los ratones Tc1 llevan un casete de resistencia a la neomicina insertado en el hChr.21, cuya selección reduce el mosaicismo del hChr.21 (15). Por tanto, primero enriquecimos los fibroblastos Tc1 adultos para detectar la presencia de hChr.21 utilizando el análogo de la neomicina G418 (Fig. 3A). El DNA-FISH mostró que la gran mayoría (≥96%) de los fibroblastos Tc1 retenían hChr.21 (Fig. 3B y fig. S3B). Estos fibroblastos Tc1 se reprogramaron sin selección G418, y las iPSCs resultantes se analizaron en P2. Diez de las 16 líneas de iPSC que se generaron (62,5%) mostraron pérdida de hChr.21 en ≥10% de las células (Fig. 3, C y D, y fig. S12D). Por el contrario, tras la eliminación de G418, la hChr21 se mantuvo en los fibroblastos Tc1 cultivados durante el mismo periodo que el utilizado para la reprogramación de las iPSC (18 días) y en las líneas iPSC P6 que tenían complementos altamente parentales (>90% de hChr.21 positivos) en P2 (fig. S12, A y B). Concluimos que la pérdida de hChr.21 en las células Tc1 es promovida por la reprogramación más que por la eliminación de G418 y, por tanto, que TCL también afecta a un cromosoma accesorio.

A continuación nos preguntamos si la TCL se produce en las células humanas. Se han observado casos de pérdida cromosómica durante el cultivo de células trisómicas humanas (16, 17), pero su prevalencia y relación con la reprogramación no se ha analizado sistemáticamente. Seleccionamos líneas de fibroblastos humanos con síndrome de Klinefelter, síndrome de Down y euploides XY y XX que presentaban un mosaicismo mínimo (fig. S13, A y D), las reprogramamos y determinamos los complementos cromosómicos de las líneas iPSC resultantes. Observamos iPSCs XY y XX procedentes de fibroblastos con síndrome de Klinefelter e iPSCs euploides procedentes de fibroblastos con síndrome de Down (fig. S13, B, C, F y G). La pérdida de cromosomas fue más común en las células trisómicas que en las disómicas, lo que demuestra que la TCL también se produce durante la reprogramación humana. Sin embargo, la frecuencia de líneas iPSC altamente euploides fue menor que la observada en iPSCs de ratón derivadas de trisomías (fig. S13, F a H).

Hemos demostrado que la TCL produce iPSCs euploides a partir de ratones y pacientes trisómicos SCT y autosómicos (fig. S12E). En ratones, las iPSCs «corregidas» resultantes pueden formar espermatozoides funcionales, permitiendo la producción de descendencia cromosómicamente euploide a partir de individuos SCT infértiles. La TCL complementa las terapias de iPSC existentes para las anomalías cromosómicas (17-21). Los mecanismos que causan la TCL son desconocidos. El estrés celular asociado a la reprogramación puede seleccionar contra las células trisómicas, permitiendo la aparición de células euploides. Hemos observado una menor frecuencia de TCL en las células humanas que en las de ratón (figs. S12D y S13H). Aunque sea poco frecuente, el TCL podría ofrecer tratamientos para los pacientes infértiles de SCT en los que los enfoques alternativos no tienen éxito. Sin embargo, el uso clínico de células germinales humanas fabricadas in vitro debe considerarse cuidadosamente desde el punto de vista ético y legal (22-24). Además, habrá que desarrollar una espermatogénesis in vitro completa para evitar el riesgo de formación de teratomas a través del trasplante de células germinales.

El TCL también permite la producción de iPSC femeninas a partir de varones, lo que ofrece un potencial para la disección genética de los dimorfismos sexuales (25). Mediante la creación de líneas de iPSC isogénicas que sólo difieren con respecto a sus cromosomas sexuales, las diferencias de sexo identificadas durante el modelado de enfermedades con iPSC podrían atribuirse a efectos cromosómicos X o Y.