Reactivos de cultivo celular

Un stock de glicerol del ORF de Akt1 humano se obtuvo como vector pENTR221 de GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). El vector de destino modificado (pcDNA/FRT/TO), que contiene la etiqueta SH, fue un generoso regalo del Dr. Matthias Gstaiger (Instituto de Biología de Sistemas Moleculares, ETH Zurich, Zurich, Suiza). Las células Flp-In TREx HEK293 (#R780-07), la mezcla enzimática LR Clonase II (#11791-100), el vector pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) y Dynabeads Protein A (#100.02D) se obtuvieron de Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) se adquirió de Roche. DMEM (#12430-054) y RPMI 1640 (#22400-089) se obtuvieron de GIBCO. La tripsina (#CC5027.010L) se adquirió en Genetics. Los FBS normales (#SH30070.03), así como los FBS examinados por Tet (#SH30070.03T) se obtuvieron de Hyclone. La afidicolina (#A0781-10MG), el nocodazol (#M1404-10MG), el yoduro de propidio (#P4170-250 mg) y la proteasa Lys C (#P3428) se obtuvieron de Sigma. Las etiquetas SILAC se obtuvieron de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. El cóctel de inhibidores de la proteasa (100X) (#78429) y las perlas de agarosa Pierce anti-HA (#26182) se obtuvieron de Thermo Scientific. Las perlas MagStrep ‘Type 2HC’ (#2-1612-002) se obtuvieron de IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India, sintetizó el péptido HA. La membrana de nitrocelulosa (#RPN303E) se compró a GE Healthcare. La tripsina proteasa (#4370282) se adquirió de AB Sciex. El marcador de peso molecular de las proteínas del arco iris (#RPN800E) era de Amersham. Los siRNAs, el reactivo de transfección Dharmafect (#T-2001-03), el agua libre de RNasa (#B-003000-WB-100), el tampón 5X para siRNA (#B-002000-UB-100) se obtuvieron de Dharmacon. La RNasa A (#19101) era de Qiagen.

Anticuerpos para Western Blot

Los anticuerpos utilizados en el presente estudio fueron: anti-HA (#SC-7392; monoclonal de ratón, dilución 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; monoclonal de ratón, dilución 1:1000) y anti-GAPDH (#SC-25778; policlonal de conejo, dilución 1:1000) de Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; policlonal de conejo, dilución 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; policlonal de conejo, dilución 11000) de Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; monoclonal de conejo, dilución 1:10000); anti-API5 (#ab56392; monoclonal de ratón, dilución 1:1000) y anti-SH3PX1 (#EPR14399; monoclonal de conejo, dilución 12000) de Abcam; los anticuerpos secundarios se obtuvieron de Licor Biosciences-Odyssey anti ratón de cabra (#926-32210, dilución 1:15000) y Odyssey anti conejo de cabra (#926-32211, dilución 1:15000).

Generación de línea celular estable

En este estudio, se utilizó el vector de entrada Akt1 compatible con la puerta de enlace (pENTR221) para generar una construcción de expresión mediante una reacción de recombinación LR en presencia de un vector de destino adecuado (pcDNA/FRT/TO). El vector de destino se modificó para incluir una etiqueta Strep-HA (SH) que contenía un péptido de unión a estreptavidina (Strep) y una etiqueta epitópica de hemaglutinina (HA). Esta etiqueta SH se utilizó finalmente para extraer selectivamente Akt1 y sus socios de interacción de lisados celulares complejos. Para generar una línea celular de expresión inducible de Akt1, el constructo de expresión se co-transfectó con la recombinasa pOG44 en células Flp-In TREx HEK293, que expresaban de forma estable el represor Tet. La transfección se facilitó con el reactivo de transfección Xtremegene 9. Las células que expresaban el constructo Akt1 se seleccionaron durante un periodo de 15-20 días en higromicina-B (75 µg/ml) que contenía medio RPMI, suplementado con un 10% de FBS con represor Tet. La concentración de Tet necesaria para la expresión óptima de Akt1 se determinó induciendo la expresión de Akt1 en un rango de concentraciones de Tet (0,1 µg/ml a 5 µg/ml) y los niveles de expresión proteica de Akt1 se monitorizaron en presencia y ausencia de Tet utilizando anticuerpos anti-Akt1 y anti-HA. Se añadió Tet a los medios de cultivo cada 24 horas para mantener una expresión constante de Akt.

Experimento de Tet

La Tet para las células HEK293 se monitorizó en células normales frente a las que sobreexpresaban Akt1 durante las 72 horas posteriores a la administración inicial de Tet. Para cada punto de observación, se sembró un conjunto paralelo de 104 células HEK293 normales y con sobreexpresión de Akt1 por triplicado, en una placa de 96 pocillos en 100 µl de medio DMEM con 10% de suero. Se añadió Tet al medio de cultivo 24 horas después de la siembra y, tras otro intervalo de incubación de 24 horas, se cosecharon las células como tiempo 0. A partir de entonces, se cosechó un conjunto de células, en cultivo paralelo, cada 24 horas hasta 72 horas. La PDT se determinó contando las células en cada punto de tiempo mediante el método de tinción con azul tripán.

Etiquetado SILAC para diferenciar el interactoma de Akt1 específico de la fase del ciclo celular

Las células HEK293 que sobreexpresan Akt1 se expandieron y cultivaron en medios SILAC que contenían isótopos «ligeros» (K0R0), «medios» (K6R6) o «pesados» (K8R10) de lisina (K) y arginina (R) durante al menos 5 duplicaciones celulares para permitir la incorporación completa de la etiqueta. Al 70% de confluencia, se añadió Tet (1 µg/ml) al medio para inducir la expresión de Akt1. Las células marcadas con K0R0 se detuvieron en la fase G0 mediante la inanición de suero durante una noche, que es un método ampliamente utilizado para detener las células en la fase G042. Para ello, se sustituyó el medio de cultivo completo normal por RPMI privado de suero y las células se mantuvieron en cultivo durante 16-18 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2. Las células marcadas con K8R10 se detuvieron en la fase G1/S cultivando las células durante la noche en presencia de 5 µg/ml de afidicolina, un inhibidor reversible de la replicación del ADN nuclear eucariótico43. Del mismo modo, para la detención en fase G2, se añadieron 400 ng/ml de nocodazol al medio de cultivo de las células marcadas con K6R6 y se continuó la incubación durante 16-18 horas antes de dispersar las células. El nocodazol interfiere con la polimerización de los microtúbulos, deteniendo así las células en la fase G2/M44. Las células detenidas fueron tripsinizadas y contadas por separado mediante el método de tinción con azul tripán. Las células detenidas en las diferentes fases del ciclo celular se separaron por centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos. Se hicieron múltiples pellets de células para cada fase del ciclo celular y se almacenaron a -80 °C, hasta su uso.

Purificación por afinidad con etiqueta SH

Se mezcló el mismo número de células sobreexpresadas con Akt1 detenidas en las fases G0, G1/S y G2 en proporción 1:1:1 y se lisó en hielo durante 1 hora en tampón IP (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; cóctel de inhibidores de proteasa 1X y 1 mM PMSF). El lisado celular se limpió de restos tras la separación por centrifugación a 10.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. Los complejos proteicos Akt1 se purificaron selectivamente en conjuntos paralelos dirigiendo la etiqueta Strep y HA simultáneamente, como se indica en los manuales de los respectivos kits. Brevemente, los complejos proteicos Akt1 marcados con Strep se mezclaron con 100 µl de perlas magnéticas de estreptactina y se mantuvieron durante 1 hora de incubación en un agitador rotatorio a 4 °C. Los interactuadores no específicos se lavaron durante cinco pasos de lavado consecutivos con cinco volúmenes de perlas de tampón de lavado de estreptactina. La proteína Akt1 y sus interactores se eluyeron finalmente en dos pasos de elución con 125 µl de tampón de elución strep por elución (invitrogen). Para la purificación de los complejos proteicos de Akt1 marcados con HA, los lisados celulares limpios se incubaron con 50 µl de perlas de agarosa HA prelavadas durante 2 horas a 4 °C en un agitador rotatorio. Después de 3 lavados rápidos, con diez volúmenes de tampón TBS-T, los complejos proteicos Akt1 se eluyeron tres veces con 50 µl de péptido HA (250 µg/ml). Los pasos de purificación anteriores se realizaron para tres réplicas biológicas para purificar la proteína Akt1 y sus socios de interacción y los eluidos de Strep y HA para cada réplica se agruparon, se liofilizaron y se guardaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

Digestión de la proteína y preparación de la muestra para LC-MS/MS

Las tres réplicas biológicas se procesaron para la digestión de la proteína por separado. A la muestra liofilizada se añadieron 40 µl de bicarbonato de amonio 100 mM, se agitó bien en vórtex y se añadieron 2 µl de tampón desnaturalizador (AB Sciex). Las muestras se redujeron con 4 µl de reactivo reductor (AB Sciex) durante 1 hora a 60 °C. Se añadieron 2 µl de reactivo de bloqueo de cisteína durante 10 minutos a temperatura ambiente para bloquear los residuos de cisteína reducidos. La digestión de las proteínas se inició añadiendo 5 µl de endoproteinasa Lys C de 0,1 µg/µl. Las muestras se mantuvieron en incubación durante 4 horas en un baño de agua a 37 °C. Tras un breve centrifugado, se añadió a las muestras 1 µl de tripsina (1 µg/µl) y se continuó la incubación durante otras 12-16 horas a 37 °C. La digestión de las proteínas se terminó añadiendo una gota de ácido fórmico (FA).

Las muestras acidificadas se liofilizaron y se sometieron a la purificación de péptidos utilizando columnas monospin C-18. Antes de su uso, las columnas C-18 se acondicionaron con metanol y agua y se equilibraron además con un 3% de ACN en 0,1% de FA. Las muestras liofilizadas se disolvieron en ACN al 3% en 0,1% de AF y se cargaron en las columnas de C-18 y se dejaron ligar durante 10 minutos. Las muestras se pasaron dos veces por las columnas para asegurar una unión completa. Tras 10 lavados rigurosos con ACN al 3% en 0,1% de FA, los péptidos digeridos se eluyeron primero en ACN al 40%, seguido de dos eluciones en ACN al 60%. Finalmente, los tres eluidos se agruparon y liofilizaron, para cada réplica.

Los péptidos eluidos se redisolvieron en 500 µl de formiato de amonio 5 mM (pH 2,5) en ACN al 30% y se agitaron suavemente. El cartucho de intercambio catiónico se fijó y acondicionó antes de cargar la muestra. Después de cargar la muestra, el cartucho se lavó tres veces con formiato de amonio 5 mM (1 ml). Los péptidos se volvieron a eluir dos veces con 400 µl de formiato de amonio 500 mM (pH 2,5) en ACN al 30% por elución y los eluidos se agruparon para cada réplica de muestra y se liofilizaron.

Diseño experimental de la espectrometría de masas y fundamento estadístico

Análisis de LC-MS/MS

Todas las muestras se analizaron mediante cromatografía líquida de nanoflujo en un sistema nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) acoplado a un espectrómetro de masas triple TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Canadá). Cada réplica biológica se inyectó dos veces como réplicas técnicas. El sistema se operó utilizando un gradiente de fase binaria, con disolvente A (2% ACN en 0,1% FA) y disolvente B (98% ACN en 0,1% FA). Para lograr una reproducibilidad óptima de la entrega de la muestra, el automuestreador se operó en modo de inyección completa llenando en exceso el bucle de 1 µl con 3 µl de muestra. Para las mediciones de cada inyección de muestra, los péptidos se atraparon en una trampa cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) y se separaron en una columna cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) a un caudal de 300 nl/minuto, utilizando un gradiente lineal: 5-60% de disolvente B en 80 minutos, 60-90% durante 2 minutos. La columna se regeneró lavando con un 90% de disolvente B durante 6 minutos y se reequilibró con un 5% de disolvente B durante 22 minutos.

El espectrómetro de masas se acopló a una fuente de iones Nano Spray (AB Sciex), controlada por el software Analyst (v.1.6). La fuente de iones estaba equipada con un emisor SilicaTip electrospray PicoTip de 10 μm (AB Sciex) y los péptidos eluidos se monitorizaron mediante los siguientes parámetros de la fuente de iones: IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gas cortina = 25. El espectrómetro de masas se operó en el modo de adquisición dependiente de la información (IDA) top10 y en el modo de alta sensibilidad con un tiempo de acumulación de 500 y 200 ms para los escaneos MS1 y MS2, respectivamente, y una exclusión dinámica de 12 s, lo que dio como resultado un ciclo de trabajo total de ~2,55 s. El análisis del espectrómetro de masas se realizó utilizando escaneos de estudio TOF-MS1 y MS2 que oscilaban entre 350-1250 y 140-1600 m/z, respectivamente. La energía de colisión rodante se controló automáticamente mediante el script de parámetros de energía de colisión rodante de IDA. Los criterios de selección del ion padre a fragmentar incluían la intensidad -donde los iones tenían que ser mayores de 150 cps-, la tolerancia de masa de 50mDa, con un estado de carga de +2 a +5. Se realizó una autocalibración de los espectros después de la adquisición de cada 2 muestras utilizando LC-MS dinámica y adquisiciones MS/MS de 25fmol de β-galactosidasa.

Procesamiento y análisis de datos

La adquisición MS-MS de Akt1 y sus socios proteicos interactuantes se realizó en 3 fases diferentes del ciclo celular, es decir, fase G0, G1/S y G2. Las células marcadas con SILAC que representaban cada fase se agruparon en tres conjuntos separados y se analizaron como réplicas biológicas. La adquisición de cada réplica biológica dio lugar a 2 archivos wiff y 2 wiff.scan, que representaban sus réplicas técnicas. Los archivos wiff se agruparon de nuevo para cada réplica biológica antes de realizar la búsqueda en la base de datos UniProtKB/SwissProt Human (publicada en abril de 2015) utilizando el software protein pilot, versión 4.5 (revisión nº 1656). La base de datos de referencia constaba de 20.204 entradas de proteínas en la versión especificada. La búsqueda del piloto de proteínas se basó en el algoritmo paragon, una parte de las estadísticas por defecto del software. Se utilizaron los siguientes ajustes para las búsquedas paragon-(a) Especie como Homo sapiens, (b) Lys C y Tripsina como categorías de enzimas para las diferentes ejecuciones, (c) Máximo de escisiones perdidas = 2, (d) Modificaciones fijas como etiquetas SILAC-K6R6 y K8R10; alquilación de cisteína mediante metilmetanosulfonato (MMTS), (e) Modificaciones variables como oxidación en la metionina, que es una opción por defecto en el piloto de proteínas, (f) Identificación, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) y SILAC (Lys + 8, Arg + 10) como tipos de muestra, y (g) Parámetro de «Esfuerzo de búsqueda» «Identificación exhaustiva», que nos da una amplia búsqueda de varias modificaciones de proteínas, (h) La tolerancia de masa para los iones precursores y de fragmento fueron 0.05 y 0,1 Da, respectivamente. Para cada réplica biológica por etiqueta SILAC se generaron archivos digeridos de Lys C y tripsina. Se emplearon los siguientes parámetros para filtrar los datos con el fin de obtener un conjunto de datos seguros para el análisis posterior: (a) Se aplicó el algoritmo de corrección automática del sesgo para la relación entre el peso y la luz. Este algoritmo corrige la mezcla desigual durante la combinación de las diferentes muestras etiquetadas en un experimento y elimina cualquier sesgo experimental o sistemático. El factor de sesgo automático aumenta la precisión de la cuantificación al normalizar las variaciones en las cantidades iniciales de proteínas45, (b) Se retuvieron las proteínas con una tasa global de falsos descubrimientos (FDR) del 1% del ajuste (G-FDR-fit). El análisis FDR se realizó utilizando el software Proteomics Performance Evaluation Pipeline (PSPEP) que se instala con el software piloto de proteínas; (c) El umbral de confianza mínimo de las proteínas se fijó en el 95%; (d) Identificación de al menos un péptido único con un 95% de confianza en las tres réplicas.

Las listas de proteínas adquiridas después de la digestión con lis C y tripsina se agruparon por réplica biológica. Se promediaron los ratios de cuantificación entre las proteínas marcadas con SILAC medianas y pesadas en relación con sus homólogas más ligeras. Posteriormente, se obtuvieron tres listas de proteínas por etiqueta SILAC-K0R0, K6R6 y K8R10. A continuación se preparó una lista de unión de las proteínas identificadas; La estimación cuantitativa se curó manualmente fusionando archivos de tres réplicas biológicas para cada condición SILAC. Las proteínas que se identificaron en los tres conjuntos de réplicas se retuvieron para el análisis posterior y se promediaron los ratios cuantitativos entre las etiquetas medias y pesadas con respecto a las ligeras para estas proteínas. A continuación se preparó un archivo final combinado para K0R0 (fase G0), K6R6 (fase G2) y K8R10 (fase G1/S). Una proteína podía estar en la lista final de interactuantes de Akt1 sólo si se identificaba en los 3 conjuntos de réplicas para cualquiera de las fases del ciclo celular. A las proteínas que se identificaron pero no se cuantificaron en las tres réplicas se les asignó un valor de cuantificación de 0,01 (mínimo) o 100 (máximo) después de introducirse en las relaciones SILAC de los péptidos.

Para depurar aún más la lista de interactuadores de Akt1 de cualquier interacción no específica con la matriz de afinidad o la etiqueta per se, se sobreexpresó la GFP marcada con SH en células HEK293. Los socios de interacción de la proteína GFP se eluyeron selectivamente como se ha descrito para los complejos de la proteína Akt1. Las proteínas que se solapaban con el interactoma específico de la fase del ciclo celular de Akt1 se eliminaron de la lista de interactores de Akt1 como proteínas no específicas. Esto nos proporcionó finalmente un conjunto de datos seguros de socios de interacción para Akt1. En la Tabla Suplementaria 3 se ofrece un resumen de la información sobre las proteínas que interactúan con Akt1 y sus estimaciones de cuantificación. Dividiéndolos con el de la proporción de Akt1 en la fase respectiva se normalizaron las proporciones cuantitativas para todos los interactores de Akt1. Esto dio uniformidad a Akt1 como 1 en las fases G0, G1/S y G2.

Electroforesis en gel de poliacrilamida y Western blot

De la lista de interactuadores de Akt1 identificados, se seleccionaron aleatoriamente CDK1, CCNB1, BUB3, API5 y SH3PX1 para validar su asociación con Akt1 mediante western blot. El pellet de células que expresan Akt1 asincronizadas se lisó en tampón IP y se sometió a purificación por afinidad dirigida a la etiqueta SH como se ha descrito anteriormente. Los eluidos se agruparon y diluyeron en tampón de muestra SDS 1X y se calentaron durante 10 minutos y se resolvieron en SDS-PAGE al 10%. Las bandas de proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y ésta se bloqueó utilizando tampón de bloqueo 1:1 odyssey PBS durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se cortó la membrana para poder sondear las proteínas de diferentes tamaños con los respectivos anticuerpos primarios para validar junto con el anticuerpo anti-HA. La dilución del anticuerpo primario se realizó en tampón odyssey PBST y se incubó durante la noche a 4 °C en un agitador. Tras un lavado exhaustivo, los blots se expusieron a los respectivos anticuerpos secundarios antiratón o anti-conejo marcados con IR a una dilución de 1:15000; diluidos en tampón odisea: PBST. Las bandas se detectaron utilizando el escáner de infrarrojos odyssey.

También se realizó una co-inmunoprecipitación inversa utilizando la proteína A de Dynabeads. Los interactores de Akt1 detectados previamente se utilizaron como proteínas cebo y se sondeó Akt1 como su socio de interacción utilizando anticuerpos anti-Akt1. Los anticuerpos contra los interactores de Akt1 seleccionados se mezclaron con 50 µl de dynabeads en tubos separados a una concentración de 1:20-1:70; diluidos en 200 µl de PBST. Las mezclas de microesferas y anticuerpos se mantuvieron para su incubación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los complejos perla-anticuerpo se separaron con un separador magnético y se volvieron a suspender en 200 µl de PBST para su lavado. A continuación, se añadieron 250 µl de lisado a cada tubo y se mantuvieron en incubación a 4 °C durante 2 horas en un agitador rotatorio. Las perlas, junto con los respectivos complejos anticuerpo-antígeno, se volvieron a pelar y se lavaron tres veces con 200 µl de PBST, por lavado. A continuación, las perlas se hirvieron en 50 µl de tampón de muestra 1X SDS durante 10 minutos y posteriormente se enfriaron. El sobrenadante se cargó en SDS-PAGE al 10% y se probó mediante western blotting. Se utilizó un anticuerpo anti-Akt1 para sondear la presencia de Akt1 en la elución de API5, CCNB1, CDK1, BUB3 y SH3PX1.

Clasificación de GO

Las clases de GO que representan la función de cada interaccionador de Akt1 se determinaron a partir de las bases de datos UniProt (http://www.uniprot.org/) y EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Después de una exhaustiva curación manual, los interactores de Akt1 identificados fueron segregados en 3 clases funcionales principales, es decir, proliferación y supervivencia, metabolismo y síntesis de proteínas. El resto se representó como una clase común denominada «otros» que incluía proteínas con funciones como el transporte, la hematopoyesis, etc.

Disminución de genes mediante siRNA

Estandarización

Para determinar la concentración óptima de siRNA para la transfección, se sembraron 1,2 × 105 células HEK293 en una placa de 12 pocillos. Se utilizó siRNA contra PLK1 como control positivo en todos los ensayos de eliminación. Se transfectó un rango de concentraciones de siRNA de 10 nM a 50 nM utilizando el reactivo de transfección dharmafect, según el protocolo del proveedor. Los cambios en los niveles de expresión proteica se monitorizaron mediante western blotting a las 24, 48 y 72 horas, respectivamente (Figura Suplementaria 2). Se eliminaron algunas dianas más (SH3PX1, AKT1, CCNB1 y SLC25A5) y el efecto de la eliminación se determinó mediante western blot. Se utilizó GAPDH como control de carga.

Disminución de las proteínas diana

Las proteínas que mostraban una asociación perturbada con Akt1 mientras la célula progresaba de la fase G0 a la fase G1/S del ciclo celular se eliminaron individualmente en células HEK293 y se investigaron mediante FACS. Cada ARNsi se resuspendió en tampón de ARNsi 1x para obtener una concentración madre de 20 µM. La transfección se realizó por triplicado 24 horas después de la siembra de las células, junto con los controles positivos y negativos apropiados. Cada siRNA se diluyó a una concentración de trabajo de 25 nM en RPMI para hacer un volumen final de 50 µl y se mantuvo a temperatura ambiente durante 5 minutos de incubación. Del mismo modo, el reactivo de transfección también se diluyó en RPMI para hacer un volumen de 50 µl y se mantuvo para la incubación en condiciones similares. Tanto el siRNA como el reactivo de transfección se mezclaron suavemente para formar complejos y se continuó la incubación durante otros 20 minutos a temperatura ambiente. El volumen final se completó con 500 µl de medio con un 10% de suero. Estos complejos se añadieron suavemente a las células y se continuó la incubación a 37 °C. El medio de cultivo celular se sustituyó por medio fresco al 10% después de 24 horas. Finalmente, 48 horas después de la transfección, se determinó la eficacia de la transfección mediante el seguimiento de siGLO en el microscopio invertido Nikon Ti.

Adquisición y análisis de FACS

A las 48 horas después de la transfección, se centrifugaron brevemente las células y se aspiró el medio. Las células se tiñeron con 300 µl de solución de yoduro de propidio que contenía 0,1 mg/ml de yoduro de propidio (Sigma), 3 µl/ml de Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml de citrato de sodio (Sigma) y 20 µg/ml de RNasa (Sigma) durante 30 minutos a 4 °C. Las células teñidas se transfirieron inmediatamente a tubos BD FACS y se adquirieron en BD FACS Canto.

Los datos obtenidos se analizaron utilizando el software FlowJo. Se analizaron los histogramas de ADN para cuantificar las poblaciones sub G0, G0/G1, S y G2/M. Se observaron cambios menores en las poblaciones G0/G1 y G2/M y, por lo tanto, se realizó una separación manual para analizar estas poblaciones.

Cálculo de la PDT y la RT

Se calculó la PDT y la RT en las fases G1, S y G2 del ciclo celular tras la eliminación con ARNsi del conjunto de proteínas que mostraban una asociación perturbada con Akt1 en la fase G1/S. La PDT para los 23 genes, junto con los controles, se monitorizó en células HEK293 durante 72 horas de duración. Brevemente, se sembraron 10.000 células en una placa de 96 pocillos, en 100 µl de medio RPMI con 10% de suero. La transfección de siRNA se realizó al día siguiente por triplicado para cada proteína objetivo y se consideró como punto de tiempo de 0 horas. El recuento de células se determinó para las células HEK293 no tratadas mediante el método de tinción con azul tripán. Después de 24 horas, el medio de cultivo celular que contenía los complejos de ARNsi se sustituyó por RPMI fresco con un 10% de suero. A partir de entonces, se contaron las células para cada una de las células transfectadas con ARNsi para representar el punto de tiempo de 24 horas. A continuación, se cosechó un conjunto de células, en cultivo paralelo, y se contaron en los puntos temporales de 48 horas y 72 horas, respectivamente.

Una vez que se determinó el PDT para todo el conjunto de genes perturbados, se calculó el RT (en horas) para cada uno de ellos para la fase G1, S y G2 de la siguiente manera:

where; El % de la población de células se determinó mediante la adquisición de FACS.

Disponibilidad de los datos

Los datos de espectrometría de masas se depositaron como conjunto de datos «Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.» a ProteomeXchange a través de la base de datos PRIDE. Está disponible públicamente a través de ProteomeXchange con el identificador ProteomeXchange: PXD005557. El conjunto de datos consta de 12 archivos en bruto (wiff y wiff.scan) y 18 archivos piloto de proteínas asociados.